背景技術：
1、膽道癌是世界范圍內比較罕見的癌癥。2020年，報告了11.6萬例新病例。在膽道癌發(fā)病機制中起作用的最重要的疾病病因包括膽結石、慢性炎癥、膽囊息肉、肥胖、毒性外源性因素和遺傳因素。膽道癌通常無癥狀發(fā)展，當出現(xiàn)癥狀時，癥狀是不典型和非特異性的。在實驗室檢測中，觀察到血清膽紅素、堿性磷酸酶、γ-谷氨酰轉肽酶和轉氨酶活性升高。血液中癌癥標志物也經常升高，主要是癌癥抗原19-9和癌胚抗原。膽道癌被歸類為預后不良的癌癥，尤其是如果診斷時在晚期進行的。
2、如果懷疑膽道癌，需要進行大量的影像學檢查。對患者來說非常重要、便宜且安全的主要檢查是腹部超聲檢查，對膽囊和膽管進行評估。補充檢查包括腹部ct掃描、mri、內鏡逆行胰膽管造影、磁共振胰膽管造影。目前尚無可用于膽道癌早期檢測的檢測方法。眾所周知，癌癥細胞的起始、生長和擴散過程涉及許多因素，包括許多酶，特別是水解酶，尤其是蛋白水解酶。這種酶催化蛋白質和肽的酶切割(水解或蛋白水解)成更小的片段。這一過程使癌癥細胞能夠通過定殖新組織而擴張，增強血管形成(血管生成)的過程，從而能夠有效地向腫瘤輸送營養(yǎng)物質。此外，這些酶是由于腫瘤生長過程導致健康細胞死亡的結果。所有這些過程形成了癌癥細胞酶(蛋白水解)活性的特征性和特異性特征，這是腫瘤的特征。
3、在這個領域，已知有發(fā)色肽分子會被酶分解成更小的片段，導致被測溶液的顏色發(fā)生變化或增加。這種發(fā)色效應是發(fā)色肽分子釋放發(fā)色團(如4-硝基苯胺或2-氨基苯甲酸)的結果。
4、例如，erlanger?bf、kokowskyn、cohenw.erlanger?bf,kokowskyn,cohenw.,“thepreparation?and?properties?oftwo?new?chromogenic?substrates?of?trypsin”,archbiochem?biophys.,1961年11月；95:271-8and?hojo?k,maeda?m,iguchi?s,smith?t,okamoto?h,kawasaki?k.amino?acids?and?peptides.xxxv.“facile?preparation?of?p-nitroanilide?analogs?by?the?solid-phase?method”,chem?pharm?bull(tokyo),2000年11月；48(11):1740-4.介紹了這種發(fā)色分子及其用途。
5、然而，到目前為止，這類化合物在診斷癌癥膽道中的應用還沒有被描述。
6、現(xiàn)有技術中也已知獲得發(fā)色肽的方法，該方法包括在適當?shù)臅r間和化學計量條件下連接單個成分。連接過程包括后續(xù)步驟，其中連接單個元素(氨基酸衍生物)，洗掉殘基，依次去除保護基團并再次洗滌。對每個氨基酸殘基重復該循環(huán)。通過在酸性條件下的反應將獲得的肽與樹脂分離。隨后，在過濾過程中將溶液與樹脂分離，然后通過非極性溶劑從溶液中沉淀肽。
7、然而，適用于膽道癌的特異性和早期診斷的發(fā)色肽化合物或獲得它們的方法在現(xiàn)有技術中是未知的。
8、因此，在該領域中，迫切需要用于膽道癌的“癌癥標志物”，該標志物將能夠以非侵入性和可靠的方式對膽道癌進行早期、敏感和特異性診斷，以及使用這種診斷標志物的診斷方法和治療方法。
9、本發(fā)明的目的是提供一種用于膽道癌的新的特異性診斷標志物和使用這種標志物用于膽道癌的非侵入性、快速、敏感和特異性的早期檢測的診斷方法，其也適用于篩選測試，以及使用這種標記的治療方法。
10、這些目的已經通過所附專利權利要求中定義的發(fā)明實現(xiàn)，而其優(yōu)選變體在從屬權利要求中進行了定義。
技術實現(xiàn)思路
1、本發(fā)明提供了一種具有式1的化合物：
2、x11-glu2-arg3-arg4-ala5-x26(式1)，
3、其中x1包含分子c1或由分子c1組成，x2包含分子c2或由分子c2組成，
4、其中所述分子對c1和c2是一對熒光供體和熒光受體，
5、并且其中所述化合物被酶切割成片段x1-glu-arg-arg-ala-oh(片段1)和x2(片段2)，并且在分子c1和c2空間分離時產生可測量的光信號。
6、本發(fā)明化合物優(yōu)選發(fā)生水解裂解，更優(yōu)選蛋白水解。
7、優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明的化合物中，分子對c1和c2選自：2-氨基苯甲酸(abz)/5-氨基-2-硝基苯甲酸(anb)、(abz)/pna、abz/anb-nh2、abz/dnp、abz/eddnp、edans/dabcyl、tam/dansyl、abz/tyr(3-no2)，更優(yōu)選地，c1和c2對是(abz)/pna或abz/anb-nh2。
8、優(yōu)選地，本發(fā)明的化合物是具有式2：abz-glu-arg-arg-ala-anb-nh2(式2)的化合物或具有式3：abz-glu-arg-arg-ala-pna(式3)的化合物。
9、更優(yōu)選地，本發(fā)明化合物發(fā)生水解裂解，產生以下片段1：abz-glu-arg-arg-ala-oh和片段2：anb-nh2。
10、本發(fā)明還提供了一種用于檢測受試者體液中存在的酶活性，特別是來源于膽道癌細胞的酶活性的體外方法，包括：
11、a)使體液樣品與式1化合物接觸：
12、x11-glu2-arg3-arg4-ala5-x26(式1)，
13、其中x1包含分子c1或由分子c1組成，x2包含分子c2或由分子c2組成，
14、其中所述一對分子c1和c2是一對熒光供體和熒光受體，
15、并且其中所述化合物被酶切割成片段x1-glu-arg-arg-ala-oh(片段1)和x2(片段2)，以及
16、b)檢測分子c1和c1空間分離時產生的可測量光信號。
17、在根據(jù)本發(fā)明的檢測酶活性的方法中，酶活性優(yōu)選為水解活性，更優(yōu)選為蛋白水解活性。
18、在根據(jù)本發(fā)明的檢測酶活性的方法中，優(yōu)選使用式2：abz-glu-arg-arg-ala-anb-nh2(式2)的化合物或式3：abz-glu-arg-arg-ala-pna(式3)的化合物作為所述化合物。
19、在根據(jù)本發(fā)明的檢測酶活性的方法中，作為所述體液，優(yōu)選使用尿液，更優(yōu)選使用人尿液。
20、本發(fā)明還涉及一種用于診斷膽道癌的體外方法，其中通過測量來自檢查受試者的體液樣品中膽道癌特異性酶活性來檢測受試者中膽道癌的存在或不存在，并且其中所述酶活性的缺失指示膽道癌的不存在，而所述酶酶活性的存在指示膽道癌的存在。
21、在根據(jù)本發(fā)明的膽道癌的檢測/診斷方法中，酶活性的檢測通過如上定義的酶活性檢測方法進行。
22、在根據(jù)本發(fā)明的膽道癌的檢測/診斷方法中，使用具有式1的化合物進行所述酶活性的測量：
23、x11-glu2-arg3-arg4-ala5-x26(式1)，
24、其中x1包含分子c1或由分子c1組成，x2包含分子c2或由分子c2組成，
25、其中所述分子對c1和c2是一對熒光供體和熒光受體，
26、并且其中所述化合物發(fā)生酶切割成片段x1-glu-arg-arg-ala-oh(片段1)和x2(片段2)，并且在分子c1和c2空間分離時產生可測量的光信號。
27、在根據(jù)本發(fā)明的膽道癌的檢測/診斷方法中，所述體液樣品與所述化合物優(yōu)選在具有中性或堿性ph，更優(yōu)選生理性ph的測量緩沖液中孵育，在樣品與測量緩沖液的比例為1∶2至1∶10，優(yōu)選1∶5的范圍內。
28、在根據(jù)本發(fā)明的膽道癌的檢測/診斷方法中，所述化合物優(yōu)選以0.1-10mg/ml，特別是0.25-7.5mg/ml的濃度使用。
29、在根據(jù)本發(fā)明的膽道癌的檢測/診斷方法中，作為所述化合物，優(yōu)選使用具有式2：abz-glu-arg-arg-ala-anb-nh2(式2)的化合物或具有式3：abz-glu-arg-arg-ala-pna(式3)的化合物。
30、在根據(jù)本發(fā)明的膽道癌的檢測/診斷方法中，作為所述樣品，優(yōu)選使用尿液樣品，更優(yōu)選使用人尿液。
31、在根據(jù)本發(fā)明的用于檢測/診斷膽道癌的方法中，所述酶活性的測量優(yōu)選包括在40-60分鐘期間在25-40℃、更優(yōu)選36-38℃范圍內的溫度下在300-500nm、更優(yōu)選380-430nm、特別是405nm范圍內的吸收強度的測量。
32、本發(fā)明還提供了一種試劑盒，其包含如上所述的任何本發(fā)明化合物和測量緩沖液。
33、在本發(fā)明的試劑盒中，所述化合物優(yōu)選為具有式2：abz-glu-arg-arg-ala-anb-nh2的化合物或具有式3：abz-glu-arg-arg-ala-pna的化合物。
34、本發(fā)明還提供了如上定義的任何本發(fā)明化合物用于檢測膽道癌特異性酶活性的用途。
35、本發(fā)明還提供如上定義的任何本發(fā)明化合物用于診斷膽道癌的用途。
36、優(yōu)選地，在這種用途中，膽道癌的診斷包括原發(fā)性膽道癌的檢測、癌癥手術切除后微小殘留病變的檢測和/或膽道癌復發(fā)的檢測。
37、優(yōu)選地，本發(fā)明用途中的化合物是具有式2：abz-glu-arg-arg-ala-anb-nh2的化合物或具有式3：abz-glu-arg-arg-ala-pna的化合物。
38、本發(fā)明還提供了如上定義的任何本發(fā)明化合物，其用作檢測膽道癌的診斷標志物。
39、優(yōu)選地，用作本發(fā)明診斷標志物的化合物是具有式2：abz-glu-arg-arg-ala-anb-nh2的化合物或具有式3：abz-glu-arg-arg-ala-pna的化合物。
40、本發(fā)明還提供了一種用于治療膽道癌的方法，其中
41、a)在來自受試者的體液樣品中通過如上定義的任何方法檢測膽道癌特異性酶活性的存在，以及
42、b)如果在所述樣品中發(fā)現(xiàn)所述酶活性的出現(xiàn)，則在受試者中應用膽道癌治療。
43、優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明的治療方法中，在根據(jù)點b)的治療結束后，以預定的時間間隔監(jiān)測所述膽道癌特異性酶活性。
44、優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明的治療方法中，使用尿液樣品，優(yōu)選人尿液作為樣品。
45、優(yōu)選地，在本發(fā)明的治療方法中，使用式2：abz-glu-arg-arg-ala-anb-nh2的化合物或式3：abz-glu-arg-arg-ala-pna的化合物作為所述化合物。