本公開涉及生物工程。特別地，本公開涉及工程化的細菌，如包含經(jīng)修飾的共價交聯(lián)的菌毛(covalently-linked?pili,clp)的谷氨酸棒狀桿菌(corynebacteriumglutamicum)。
背景技術：
：：1、工程化的活體功能材料(engineered?living?material,elm)涉及具有獨特“活”屬性的工程化的活體功能材料，例如僅在天然活體功能材料中發(fā)現(xiàn)的自主生長、自我修復和環(huán)境響應性，已經(jīng)開發(fā)了廣泛的卓越的elm，用于生物傳感器、生物修復、生物醫(yī)學、生物制造、可穿戴設備和電子設備。根據(jù)其結構組件的來源，可以通過利用工程細胞同時制造材料并將新功能融入其中(稱作自組裝的活體功能材料或生物elm)或者通過將活細胞包埋在有機或無機基質中(稱作雜化的活體功能材料)來生產(chǎn)elm。自組織活體功能材料旨在重現(xiàn)天然活體功能材料的自主、適應性和多功能特性，并且為利用工程化的生物系統(tǒng)獲得新能力提供機會。2、盡管elm取得了進展，但由于缺乏可工程化的底盤以及微生物(特別是非致病菌)中可編程內(nèi)源性生物聚合物的有限可及性，自組織活體功能材料的進一步開發(fā)和應用仍面臨挑戰(zhàn)。目前，只有模式微生物系統(tǒng)，如大腸桿菌(escherichia?coli)和枯草芽孢桿菌(bacillus?subtilis)及其胞外淀粉樣纖維，以及幾種非模式系統(tǒng)，包括產(chǎn)生細菌纖維素的紅茶菌(k.rhaeticus)、含有s層晶格蛋白(surface-layer?protein)的新月柄桿菌(caulobacter?crescentus)和真菌天然原料中的成團泛菌(pantoea?agglomerans)的優(yōu)勢細菌組分，(tang,t.-c.et?al.,materials?design?by?syntheticbiology.nat.rev.mater.6,332-350,2021；caro-astorga,j.et?al.,bacterialcellulose?spheroids?asbuilding?blocks?for?3d?and?patterned?living?materialsand?for?regeneration.nat.commun.12,1-9,2021；charrier,m.et?al.engineering?thes-layer?of?caulobacter?crescentus?as?a?foundation?for?stable,high-density,2dliving?materials.acs?synth.biol.8,181-190,2018；and?huang,j.et?al.programmableand?printable?bacillus?subtilis?biofilms?as?engineered?livingmaterials.nat.chem.biol.15,34-41,2019)。3、一些革蘭氏陽性細菌包含共價交聯(lián)的菌毛(clp)。與革蘭氏陰性細菌中產(chǎn)生的非共價交聯(lián)的菌毛不同(ramirez,n.a.et?al.,new?paradigms?of?pilus?assemblymechanisms?in?gram-positive?actinobacteria.trends?microbiol.28,999-1009,2020)。clp單體亞基通常通過分選酶(sortase)催化的分子間異肽鍵連接，具有巨大的拉伸強度(mcconnell,s.a.et?al.,protein?labeling?via?a?specific?lysine-isopeptidebond?using?the?pilin?polymerizing?sortase?from?corynebacteriumdiphtheriae.j.am.chem.soc.140,8420-8423,2018)。此外，clp亞基含有自催化的分子內(nèi)異肽鍵，能夠抵抗蛋白水解酶的水解(less?susceptible?to?proteolytic?cleavage)，并且可以消散機械能(ramirez,n.a.et?al.,2020)，從而賦予clp穩(wěn)健性。此外，不同菌株clp結構中的幾種菌毛蛋白含有額外的二硫鍵，進一步增強穩(wěn)定性(kang,h.j.et?al.,thecorynebacterium?diphtheriae?shaft?pilin?spaais?built?of?tandem?ig-likemodules?with?stabilizing?isopeptide?and?disulfide?bonds.proc.natl.acad.sci.u.s.a.106,16967-16971,2009)。4、因此，仍然需要為elm(如自組織活體功能材料)開發(fā)新的底盤，優(yōu)選形成clp的細菌。技術實現(xiàn)思路1、基于工業(yè)底盤宿主(workhorse)谷氨酸棒狀桿菌中共價交聯(lián)的菌毛(clp)纖維的生物合成基因簇(bgc)的發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人開發(fā)了一種elm的集成技術平臺。2、在第一方面，本公開提供一種包含載體蛋白和感興趣的多肽的融合多肽，其中所述感興趣的多肽與載體蛋白的末端融合或插入載體蛋白中，并且其中載體蛋白是來自微生物的共價交聯(lián)的菌毛(clp)的菌毛蛋白。3、在一些實施方案中，所述微生物是革蘭氏陽性細菌，如選自谷氨酸棒狀桿菌、短雙歧桿菌(bifidobacterium?breve)、乳酸乳球菌(lactococcus?lactis)、副干酪乳酪桿菌(lacticaseibacillus?paracasei)、蘇云金芽孢桿菌(bacillus?thuringiensis)和副干酪乳酪桿菌的細菌；優(yōu)選谷氨酸棒狀桿菌。在一些實施方案中，所述載體蛋白是骨架菌毛蛋白(major?pilin)。4、在一些實施方案中，所述感興趣的多肽與載體蛋白的末端融合。在一些實施方案中，所述感興趣的多肽與載體蛋白的n末端融合。5、在一些實施方案中，所述感興趣的多肽插入載體蛋白中。在一些實施方案中，所述感興趣的多肽插入載體蛋白的轉角區(qū)(loop)。6、在一些實施方案中，所述載體蛋白是來自谷氨酸棒狀桿菌的骨架菌毛蛋白。在一些實施方案中，所述感興趣的多肽插入骨架菌毛蛋白的m結構域中。在一些實施方案中，所述感興趣的多肽取代骨架菌毛蛋白的m結構域或其一部分。在一些實施方案中，所述載體蛋白包含seq?id?no:1、2、3或4的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述感興趣的多肽與載體蛋白的n末端融合，或者插入對應于seq?id?no:1的g215和l216的位置之間，對應于seq?idno:1的g236和e237的位置之間，或對應于seq?id?no:1的g336和t337的位置之間。7、在一些實施方案中，所述載體蛋白包含seq?id?no:1的氨基酸35-509。在一些實施方案中，所述感興趣的多肽與載體蛋白的n末端融合，或者插入seq?id?no:1的g215和l216之間、g236和e237之間或g336和t337之間。8、在第二方面，本公開提供編碼本公開的融合多肽的多核苷酸，包含所述多核苷酸的載體，以及包含所述多肽、所述多核苷酸或本公開的載體的宿主細胞。9、在第三方面，本公開提供一種重組細胞，其包含編碼融合多肽的多核苷酸，其中所述融合多肽包含載體蛋白和感興趣的多肽，其中所述感興趣的多肽與載體蛋白的末端融合或插入載體蛋白中，其中載體蛋白是clp的菌毛蛋白，并且其中重組細胞能夠表達所述多核苷酸并展示包含融合多肽的經(jīng)修飾的clp。10、在一些實施方案中，所述重組細胞是革蘭氏陽性細菌，如選自谷氨酸棒狀桿菌、短雙歧桿菌、乳酸乳球菌、副干酪乳酪桿菌、蘇云金芽孢桿菌和副干酪乳酪桿菌的細菌；優(yōu)選谷氨酸棒狀桿菌。在一些實施方案中，所述載體蛋白是骨架菌毛蛋白。11、在一些實施方案中，所述感興趣的多肽與載體蛋白的末端融合。在一些實施方案中，所述感興趣的多肽與載體蛋白的n末端融合。12、在一些實施方案中，所述感興趣的多肽插入載體蛋白中。在一些實施方案中，所述感興趣的多肽插入載體蛋白的轉角區(qū)。13、在一些實施方案中，所述載體蛋白是來自谷氨酸棒狀桿菌的骨架菌毛蛋白。在一些實施方案中，所述感興趣的多肽插入骨架菌毛蛋白的m結構域中。在一些實施方案中，感興趣的多肽取代骨架菌毛蛋白的m結構域或其一部分。在一些實施方案中，所述載體蛋白包含seq?id?no:1、2、3或4的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述感興趣的多肽與載體蛋白的n末端融合，或者插入對應于seq?id?no:1的g215和l216的位置之間，對應于seq?id?no:1的g236和e237的位置之間，或對應于seq?id?no:1的g336和t337的位置之間。14、在一些實施方案中，所述載體蛋白包含seq?id?no:1的氨基酸35-509，并且所述感興趣的多肽與載體蛋白的n末端融合，或者插入seq?id?no:1的g215和l216之間、g236和e237之間或g336和t337之間。15、在一些實施方案中，所述重組細胞包含兩種或更多種多核苷酸，分別編碼兩種或更多種融合多肽，每個融合多肽包含不同的感興趣的多肽，經(jīng)修飾的clp包含這兩種或更多種多肽。16、在第四方面，本公開提供一種制備本公開的重組細胞的方法，包括將編碼本公開的融合多肽的多核苷酸引入衍生自具有clp的微生物的宿主細胞中。17、在一些實施方案中，所述宿主細胞的天然骨架菌毛蛋白被敲除。在一些實施方案中，所述方法包括天然骨架菌毛蛋白敲除的步驟。18、在第五方面，本公開提供一種經(jīng)修飾的共價交聯(lián)的菌毛(clp)，其包含多種本公開的融合多肽。19、在第六方面，本公開提供一種制備經(jīng)修飾的clp的方法，包括以下步驟20、a)提供本公開的融合多肽；以及21、b)提供分選酶活性。22、在一些實施方案中，通過轉錄和/或翻譯本公開的多核苷酸來提供融合多肽。在一些實施方案中，通過轉錄和/或翻譯一種或多種編碼分選酶的多核苷酸來提供分選酶活性。在一些實施方案中，所述分選酶由基因編碼，該基因被鑒定為與自然界中編碼載體蛋白的基因存在于同一簇中。在一些實施方案中，所述分選酶是c類分選酶，如srtc1和/或srtc2，優(yōu)選其中srtc1和srtc2由來自同一簇的基因編碼。在一些實施方案中，所述方法是體外方法。23、在第七方面，本公開提供一種多核苷酸構建體或多核苷酸構建體的組合，其包含本公開的多核苷酸，以及一種或多種編碼分選酶的多核苷酸。24、在一些實施方案中，所述分選酶由基因編碼，該基因被鑒定為與自然界中編碼載體蛋白的基因存在于同一簇中。在一些實施方案中，所述分選酶是c類分選酶，如srtc1和/或srtc2，優(yōu)選其中srtc1和srtc2由來自同一簇的基因編碼。當前第1頁12當前第1頁12