本發(fā)明屬于多肽合成，具體涉及一種替爾泊肽的制備方法。
背景技術(shù)：
1、替爾泊肽(tirzepatide)是由禮來開發(fā)的一種同時激活兩種腸促胰島素受體的激動劑。fda于2022年5月13日批準(zhǔn)用于治療2型糖尿病(商品名mounjaro)，于2023年11月8日批準(zhǔn)替爾泊肽用于成年人肥胖治療(商品名zepbound)。替爾泊肽是一個39個氨基酸長的多肽分子，在20位lys有一個20碳的脂肪酸修飾，分子式為c225h348n48o68，分子量為4813.53da。其肽序如下式所示：
2、
3、該藥物在與司美格魯肽頭對頭試驗中，表現(xiàn)出了更為優(yōu)秀的降糖和減重效果，市場需求強勁，據(jù)svb?securities分析，到2030年，該藥銷售額可能達到246億。因此，其原料藥需求巨大。
4、原研專利cn113330024a采用了四個片段合成工藝，粗肽純度70％，合成總收率44.4％。而片段拼接后除去副產(chǎn)物需要用納濾技術(shù)，納濾對濾膜的要求非常高(200da和400da)，國內(nèi)的濾膜無法達到這一精細(xì)水平。因此，該技術(shù)在國內(nèi)難以實現(xiàn)。原研專利cn113330024a也采用逐步偶聯(lián)工藝，采用氨基樹脂進行逐步偶聯(lián)完成39肽主鏈合成，然后脫去lys(ivd?de)的側(cè)鏈保護基ivdde，再偶聯(lián)片段(aeea)2-γ-glu-c20diacid，粗肽純度64％，合成總收率47.0％。專利cn112592387b、cn115651075b、cn110903355a采用片段fmoc-lys(aeea-a?eea-γglu(α-otbu)-eicosanedioicacid(mon-tbu))-oh作為起始物料或中間體進行合成，粗肽純度70％～80％之間。但是這些專利tfa裂解液的用量均較高(裂解試劑8～10ml/克樹脂)，醚類溶劑的用量則高達80～100ml/克樹脂，將給生產(chǎn)帶來大量醚類廢液，這些醚類廢液因為含有較高濃度的三氟乙酸無法通過蒸餾方式回收利用。tfa對于多肽而言，具有較高的溶解度，使用大量的tfa裂解，不利于多肽的析出，否則需要大量的醚類溶劑進行沉淀，這將需要較大的沉降釜，否則裂解批量會受到限制。另外，裂解液中替爾泊肽的濃度較低，在用醚類溶劑進行沉降的過程中，不利于形成粒徑較大的沉降顆粒，得到的沉降液像牛奶狀，無法用濾布或者濾紙進行過濾，只能采用杯式離心機(原理是利用替爾泊肽密度與沉降試劑密度差異分離)進行分離，無法采用過濾的方式使粗肽得到有效分離，這同樣使得大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)受到極大限制。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、為了解決上述問題，本發(fā)明旨在提供一種替爾泊肽的制備方法。本發(fā)明采用siber樹脂作為起始固相載體，按標(biāo)準(zhǔn)fmoc固相合成操作依序完成肽鏈合成，然后用體積分?jǐn)?shù)為3％～5％tfa的dcm溶液進行肽鏈切割(用量為8～10ml/克全保護肽樹脂)，過濾除去廢樹脂，得到的濾液減壓濃縮至粘稠狀固體。得到的粘稠固體直接加入裂解試劑(用量2～2.5ml/克全保護肽樹脂)脫除側(cè)鏈保護基。然后加入醚類試劑(用量為8～10ml/克全保護肽樹脂)中進行沉淀，沉淀物進行過濾得到替爾泊肽粗品。采用該工藝，可以減少70％tfa的用量，從而使得裂解液中替爾泊肽的濃度提高，進一步需要的沉降溶劑醚類用量也減少90％，析出的顆粒容易使用濾布或者濾紙過濾。從而不但解決沉降釜體積對裂解批量的限制，而且解決了沉降液固液分離的問題，極大的提高了生產(chǎn)效率，降低了生產(chǎn)成本。
2、具體技術(shù)方案如下：
3、本發(fā)明提供一種替爾泊肽的制備方法，包括如下步驟：
4、步驟1：按照常規(guī)fmoc固相合成方法，采用sieber樹脂作為固相合成載體，依序偶聯(lián)，獲得全包護肽樹脂boc-tyr(tbu)-aib-glu(otbu)-gly-thr(tbu)-phe-thr(tbu)-ser(tbu)-asp(otbu)-tyr(tbu)-ser(tbu)-ile-aib-leu-asp(otbu)-lys(boc)-ile-ala-gln(trt)-lys(aeea-aeea-γglu(α-otbu)-eicosanedioicacid(mon-tbu))-ala-phe-val-gln(trt)-trp(boc)-leu-ile-ala-gly-gly-pro-ser(tbu)-ser(tbu)-gly-ala-pro-pro-pro-ser(tbu)-sieber?resin；
5、步驟2：用體積分?jǐn)?shù)為3％～5％的tfa的dcm溶液對步驟1所述的全保護肽樹脂進行切割，得到全部護肽boc-tyr(tbu)-aib-glu(otbu)-gly-thr(tbu)-phe-thr(tbu)-ser(tbu)-asp(otbu)-tyr(tbu)-ser(tbu)-ile-aib-leu-asp(otbu)-lys(boc)-ile-ala-gln(trt)-lys(aeea-aee?a-γglu(α-otbu)-eicosanedioicacid(mon-tbu))-ala-phe-val-gln(trt)-trp(boc)-leu-ile-ala-gly-gly-pro-ser(tbu)-ser(tbu)-gly-ala-pro-pro-pro-ser(tbu)-nh2的溶液，過濾除去廢樹脂，所得濾液濃縮至粘稠狀固體；
6、步驟3：向步驟2得到的粘稠狀固體中加入裂解試劑，進行裂解，脫除側(cè)鏈保護基，裂解結(jié)束后加入醚類溶劑進行沉降，沉淀物經(jīng)過濾、干燥，即得到替爾泊肽粗品。
7、進一步地，步驟1中肽樹脂的合成過程中除了使用常規(guī)的保護氨基酸，還使用了以下片段fmoc-lys(aeea-aeea-γglu(α-otbu)-eicosanedioic?acid(mon-tbu))-oh、boc-tyr(tbu)-aib-oh、fmoc-ile-aib-oh及fmoc-gly-gly-oh，按照如下表所示肽順序依次偶聯(lián)：
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10、進一步地，步驟1中所述fmoc常規(guī)固相合成方法為：以siber樹脂作為固相載體，樹脂替代度為0.3～0.8mmol/g，優(yōu)選為0.5～0.6mmol/g；將樹脂用溶劑進行溶脹，所述溶劑選自dmf、nmp、二氯甲烷等，優(yōu)選為dmf；依序偶聯(lián)各種氨基酸及片段，直至用茚三酮檢測方法檢測到反應(yīng)終止為止，fmoc-保護氨基酸或保護氨基酸片段的用量為所投料樹脂總摩爾數(shù)的2～4倍，優(yōu)選為3倍；偶聯(lián)劑為dipcdi和化合物a的組合物或dipea、化合物a和化合物b的組合物，其中化合物a為hoat、hobt或oxymapure，化合物b為pyaop、pybop、hatu、hbtu或tbtu，優(yōu)選為dipcdi和化合物a的組合物。脫fmoc保護試劑為20％的哌啶/dmf溶液。
11、進一步地，步驟2所述體積分?jǐn)?shù)為3％～5％的tfa的dcm溶液溶劑用量為8～10ml/克全保護肽樹脂；
12、進一步地，步驟2中所述切割的反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度為20～35℃，反應(yīng)時間為2～4小時。
13、進一步地，步驟2中所得濾液經(jīng)真空濃縮至粘稠狀固體。
14、進一步地，步驟3中所述裂解試劑的用量為2～2.5ml/克全保護肽樹脂。
15、進一步地，步驟3中所述裂解試劑為edt、dtt、dodt一種或幾種與tfa、tis、h2o的混合溶劑；優(yōu)選地，所述裂解試劑為tfa、dtt、tis、h2o的混合溶劑；優(yōu)選地，所述tfa:dtt:tis:h2o的質(zhì)量比為91:3:3:3。
16、進一步地，步驟3中所述裂解的反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度為20～30℃，反應(yīng)時間為2～4小時。
17、進一步地，步驟3中所述醚類試劑的用量為8～10ml/克全保護肽樹脂；
18、優(yōu)選地，步驟3中所述醚類試劑為甲基叔丁基醚；
19、優(yōu)選地，步驟3中所述醚類試劑預(yù)冷至-8～-5℃。
20、進一步地，步驟3中所述干燥為真空干燥。
21、本發(fā)明的有益效果為：
22、本發(fā)明采用siber樹脂作為起始固相載體，按照常規(guī)fmoc固相合成方法，依序偶聯(lián)獲得全保護肽樹脂，然后用體積分?jǐn)?shù)為3％～5％的tfa的dcm溶液進行肽鏈切割，過濾除去廢樹脂，得到的濾液減壓濃縮至粘稠狀固體，得到的粘稠狀固體直接加入裂解試劑脫除側(cè)鏈保護基，然后加入醚類試劑進行沉淀，沉淀物進行過濾和干燥，得到替爾泊肽粗品。采用本發(fā)明替爾泊肽制備工藝，可以減少70％tfa的用量，從而使得裂解液中替爾泊肽的濃度提高，進一步地需要的沉降溶劑醚類用量也減少90％，析出的顆粒容易使用濾布或者濾紙過濾，最終不但解決了沉降釜體積對裂解批量的限制，而且解決了沉降液固液分離的問題，極大地提高了生產(chǎn)效率，降低了生產(chǎn)成本。