本發明涉及生物工程，具體涉及一種基于spytag/spycatcher環化修飾的蔗糖磷酸化酶突變體及其應用。
背景技術：
1、公開該背景技術部分的信息僅僅旨在增加對本發明的總體背景的理解，而不必然被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已經成為本領域一般技術人員所公知的現有技術。
2、2-α-甘油葡萄糖苷，普遍存在于自然界中，特別是在耐鹽的藍藻細菌中，比如藍綠藻和南非密羅木（也叫不死草、復活草）。它是密羅木能在極端環境中生存和重新激活復生的最主要的活性物質，能牢牢鎖住體內珍貴的最后一滴水，因而2-α-甘油葡萄糖苷具有極強的“滋潤、鎖水、保濕”的生理效果，可作為化妝品的功能性原料；此外2-α-甘油葡萄糖苷還被用于制備口腔護理產品，如口腔噴霧劑、牙膏等，具有抗炎、抗菌、止痛等作用；在食品領域，可用于制備飲料、糖果等食品，以提升食品的質量和保質期；因而2-α-甘油葡萄糖苷具有巨大的應用價值和市場前景。
3、目前關于2-α-甘油葡萄糖苷的制備主要采用生物酶法來合成。植物提取受限于場地、來源等，不能大規模生產；化學合成存在著雜質較多的問題（合成中會引入1-甘油葡萄苷，而2-α-甘油葡萄糖苷的鎖水保濕功能最好），因而目前主要采用專一性高的生物酶法來合成。以蔗糖和甘油為原料，在蔗糖磷酸化酶的作用下生產2-甘油葡萄糖苷。
4、然而，目前報道的蔗糖磷酸化酶及其突變體存在酶活不高，穩定性不足的問題，因此達不到工業生產的要求。
技術實現思路
1、為了克服上述問題，本發明提供了一種基于spytag/spycatcher環化修飾的蔗糖磷酸化酶突變體及其應用。
2、為實現上述技術目的，本發明采用如下技術方案：
3、本發明的第一個方面，提供了一種基于spytag/spycatcher環化修飾的蔗糖磷酸化酶突變體，其由氨基酸序列如seq?id?no.2所示的野生型蔗糖磷酸化酶的第257位絲氨酸、第413位異亮氨酸經多位點同時突變獲得突變中間體，在突變中間體的n端和c端分別連接spytag和spycatcher標簽環化后獲得。
4、在一種或多種實施方式中，所述spytag標簽的核苷酸序列如seq?id?no.7所示，所述spycatcher標簽的核苷酸序列如seq?id?no.8所示。
5、在一種或多種實施方式中，突變中間體的n端通過linker1與spytag標簽連接；突變中間體的c端通過linker2與spycatcher標簽連接。
6、優選地，所述linker1的核苷酸序列如seq?id?no.9所示；
7、所述linker2的核苷酸序列如seq?id?no.10所示。
8、在一種或多種實施方式中，所述蔗糖磷酸化酶突變體中間體由氨基酸序列如seqid?no.2所示的野生型蔗糖磷酸化酶第257位絲氨酸突變為亮氨酸，第413位異亮氨酸突變為纈氨酸。
9、本發明的第二個方面，提供編碼第一方面所述的基于spytag/spycatcher環化修飾的蔗糖磷酸化酶突變體的基因。
10、本發明的第三個方面，提供一種表達盒，包含第二方面所述的基因。
11、本發明的第四個方面，提供一種重組表達載體，包含第二方面所述的基因。
12、本發明的第五個方面，提供一種重組菌，包含第二方面所述的基因。
13、本發明的第六個方面，提供一種轉基因細胞系，包含第二方面所述的基因。
14、本發明的第七個方面，提供第一方面所述的基于spytag/spycatcher環化修飾的蔗糖磷酸化酶突變體或第二方面所述的基因或第五方面所述的重組菌在催化合成2-α-甘油葡萄糖苷中的應用。
15、本發明的第八個方面，提供一種合成2-α-甘油葡萄糖苷的方法，包括：
16、以基于spytag/spycatcher環化修飾的蔗糖磷酸化酶突變體的基因工程菌經誘導培養獲得的濕菌體或濕菌體超聲破碎提取的粗酶液或固定化的酶為催化劑，以蔗糖和甘油作為底物，純凈水為反應介質構成反應體系，反應獲得2-α-甘油葡萄糖苷；
17、其中，所述基因工程菌是將第一方面所述的基于spytag/spycatcher環化修飾的蔗糖磷酸化酶突變體導入宿主菌構建而成。
18、在一種或多種實施方式中，催化劑的用量以濕菌體總重量計為5~15?g/l，所述底物蔗糖的終濃度為0.9~1.2?m，優選為1?m；底物甘油的終濃度為1.0~1.3?m，優選為1.1?m。
19、本發明的有益效果在于：
20、本發明涉及生物工程技術領域，具體涉及一種基于spytag/spycatcher環化修飾的蔗糖磷酸化酶突變體及其應用。本發明中通過對來源于腸球菌（ enterococcus?faecium）的蔗糖磷酸化酶（efspase）的野生型蔗糖磷酸化酶的第257位絲氨酸、第413位異亮氨酸經多位點同時突變獲得突變中間體，在突變中間體的n端和c端分別連接spytag和spycatcher標簽環化后獲得。基于spytag/spycatcher環化修飾的蔗糖磷酸化酶突變體在45?℃下的半衰期延長至野生型的3倍（由10小時提升至30小時），并且催化效率有了很大的提升，2-α-甘油葡萄糖苷的產量達到240.6?g/l，且經過固定化的環化酶連續使用10批次后活性保持90%以上。
1.一種基于spytag/spycatcher環化修飾的蔗糖磷酸化酶突變體，其特征在于，其由氨基酸序列如seq?id?no.2所示的野生型蔗糖磷酸化酶的第257位絲氨酸、第413位異亮氨酸經多位點同時突變獲得突變中間體，在突變中間體的n端和c端分別連接spytag和spycatcher標簽環化后獲得。
2.如權利要求1所述的蔗糖磷酸化酶突變體，其特征在于，所述spytag標簽的核苷酸序列如seq?id?no.7所示，所述spycatcher標簽的核苷酸序列如seq?id?no.8所示；
3.編碼權利要求1或2所述的蔗糖磷酸化酶突變體的基因。
4.一種表達盒，其特征在于，包含權利要求3所述的基因。
5.一種重組表達載體，其特征在于，包含權利要求3所述的基因。
6.一種重組菌，其特征在于，包含權利要求3所述的基因。
7.一種轉基因細胞系，其特征在于，包含權利要求3所述的基因。
8.權利要求1或2所述的蔗糖磷酸化酶突變體或權利要求3所述的基因或權利要求6所述的重組菌在催化合成2-α-甘油葡萄糖苷中的應用。
9.一種合成2-α-甘油葡萄糖苷的方法，其特征在于，包括：
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，催化劑的用量以濕菌體總重量計為5~15?g/l，所述底物蔗糖的終濃度為0.9~1.2?m，底物甘油的終濃度為1.0~1.3?m。