本發(fā)明涉及抗體篩選和疾病診斷的，具體而言，涉及igfbp4、ccl14蛋白的抗體及其組合在結直腸癌診斷中的應用。
背景技術：
1、igfbp4是胰島素樣生長因子結合蛋白（igfbp）家族成員之一，由258個氨基酸組成，分子量約28-32kda。其核心功能是通過高親和力結合胰島素樣生長因子（igf-1和igf-2），調控igf的生物利用度及活性。igf系統(tǒng)在細胞增殖、分化和凋亡中起關鍵作用，而igfbp4通過抑制igf與受體的結合，間接抑制igf介導的促生長和抗凋亡信號通路。此外，igfbp4的活性還可通過蛋白酶（如妊娠相關血漿蛋白-a，papp-a）切割其結合區(qū)域而釋放igf，動態(tài)調節(jié)igf信號。igfbp4在腫瘤中的角色復雜。一方面，其通過抑制igf信號發(fā)揮抑癌作用。例如，在結直腸癌中，igfbp4高表達與患者較長生存期相關，可能因抑制了igf-1驅動的腫瘤生長。另一方面，某些腫瘤（如膠質母細胞瘤）中igfbp4的過表達可能通過非igf依賴途徑（如整合素信號）促進侵襲。
2、ccl14屬于c-c基序趨化因子家族，以無活性的前體形式（ccl14-1-74）存在，經蛋白酶（如中性粒細胞彈性蛋白酶）剪切后釋放活性片段ccl14-9-74。其通過結合ccr1和ccr3受體，招募單核細胞、樹突狀細胞等免疫細胞，調節(jié)炎癥反應和免疫監(jiān)視。ccl14在腫瘤微環(huán)境中的作用呈現雙重性。在肝癌中，ccl14高表達與細胞毒性t細胞(cd8+t細胞)浸潤增加及患者生存期延長相關，提示其通過增強抗腫瘤免疫發(fā)揮抑癌作用。相反，在乳腺癌中，ccl14可能通過激活ccr1/erk通路促進腫瘤細胞轉移。此外，ccl14可誘導血管生成，其促癌或抑癌效應高度依賴腫瘤類型及微環(huán)境中的免疫細胞組成。作為預后標志物，ccl14在肝癌和腎癌中的高表達提示良好預后，而在乳腺癌中則與不良預后相關。
3、結直腸癌（crc）的診斷標志物包括多種類型，涵蓋血清學、組織學、糞便和分子標志物等。血清學標志物：癌胚抗原（cea）、糖類抗原19-9（ca19-9）、糖類抗原125（ca125）是常用的crc篩查和術后監(jiān)測標志物，但存在特異性較低的問題（炎癥、吸煙等也可升高）；糞便標志物：糞便隱血試驗（fobt），但易受飲食或胃腸道出血干擾；組織學標志物（活檢或手術標本）：病理檢查（金標準）、免疫組化標志物（微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（msi）/錯配修復（mmr），但侵入性強、成本高；分子標志物：msi/mmr、kras原癌基因（kras）/b-raf原癌基因（braf）突變、表觀遺傳標志物（甲基化基因），但靈敏度低且成本高昂。
4、專利文獻cn115466794b公開了基于胰島素樣生長因子結合蛋白7（igfbp7）、凋亡誘導因子（blcap）和肽基脯氨酰異構酶a（ppia）基因的rna編輯位點組合診斷crc，靈敏度較高，但依賴復雜的rna編輯檢測技術，成本高昂；專利cn118006789b公開了利用nadph氧化酶1等蛋白組合診斷crc，但未解決標志物在炎癥中的交叉反應問題；專利cn113398249a主要聚焦于ccl14的治療應用，如病毒載體遞送，而直接用于腫瘤早期篩查的診斷試劑或檢測方法專利較少，缺乏特異性檢測探針或快速篩查工具。現有產品基于cea+ca19-9聯合檢測的試劑盒，但對早期腫瘤（如i期）靈敏度不足（<50%）。
5、因此急需找到能高靈敏度和特異性檢測igfbp4蛋白、ccl14蛋白的抗體，并且性能穩(wěn)定，能夠高效檢測待測樣本中igfbp4和ccl14水平，能夠以igfbp4和ccl14蛋白作為聯合標志物用于結直腸癌早期診斷、療效評估和預后干預等。
技術實現思路
1、針對現有技術中存在的問題，本發(fā)明提供了一種igfbp4、ccl14蛋白的抗體及其組合和在結直腸癌診斷中的應用，通過優(yōu)化重組igfbp4和ccl14抗原的真核表達工藝，大幅提高表達量和免疫原性，其作為本發(fā)明試劑盒中的陽性質控品具有優(yōu)秀的相關性、一致性和穩(wěn)定性；通過雜交瘤技術分別篩選得到靶向igfbp4、ccl14表位的數十株抗體，并從中分別篩選出一組優(yōu)秀的配對抗體，且經過驗證可應用于酶聯免疫吸附試驗和化學發(fā)光免疫分析技術，提供了一種高靈敏度和高特異性的結直腸癌診斷標志物組合，解決現有技術中腫瘤早期篩查、分型及療效監(jiān)測的精準度不足問題。
2、現有技術方案中采用傳統(tǒng)雜交瘤技術或重組蛋白免疫動物制備抗igfbp4蛋白或抗ccl14蛋白的單克隆或多克隆抗體時，存在免疫原設計未優(yōu)化導致抗體親和力和特異性不足的問題，且現有elisa或化學發(fā)光法檢測igfbp4、ccl14蛋白或胃腸道腫瘤標志物時，未針對igfbp4和ccl14抗體的組合進行試劑盒優(yōu)化，導致檢測靈敏度和特異性較低，無法實現高效的胃腸道腫瘤（特別是結直腸癌）診斷。本發(fā)明開發(fā)了全新的igfbp4和ccl14的高特異性抗體及其組合，能夠用于診斷試劑盒的制備，檢測不同樣本中的igfbp4和ccl14，以實現臨床價值。
3、一方面，本發(fā)明提供了一種igfbp4蛋白的抗體，包括第一抗體和/或第二抗體；所述第一抗體包括：
4、（1）在重鏈可變區(qū)中的由seq?id?no.1的氨基酸序列組成的cdr1、由seq?id?no.2的氨基酸序列組成的cdr2以及由seq?id?no.3的氨基酸序列組成的cdr3，和
5、（2）在輕鏈可變區(qū)中的由seq?id?no.4的氨基酸序列組成的cdr1、由seq?id?no.5的氨基酸序列組成的cdr2以及由seq?id?no.6的氨基酸序列組成的cdr3；
6、所述第二抗體包括：
7、（3）在重鏈可變區(qū)中的由seq?id?no.7的氨基酸序列組成的cdr1、由seq?id?no.8的氨基酸序列組成的cdr2以及由seq?id?no.9的氨基酸序列組成的cdr3，和
8、（4）在輕鏈可變區(qū)中的由seq?id?no.10的氨基酸序列組成的cdr1、由seq?idno.11的氨基酸序列組成的cdr2以及由seq?id?no.12的氨基酸序列組成的cdr3。
9、本發(fā)明通過優(yōu)化重組igfbp4抗原的真核表達工藝，在真核表達系統(tǒng)中表達并純化重組蛋白，大幅提高igfbp4的表達量和免疫原性。以純化的重組蛋白為免疫原，免疫小鼠或其他適當的動物，獲得免疫脾臟細胞；采用雜交瘤技術，將免疫脾臟細胞與骨髓瘤細胞進行融合，獲得分泌抗igfbp4單克隆抗體的雜交瘤細胞株并從中篩選獲得10株針對igfbp4的高親和力、高特異性的單克隆抗體；對篩選獲得的單克隆抗體進行基因克隆、表達和純化，獲得純化的抗體產品。經三輪篩選獲得的抗體，再通過雙抗夾心elisa測試方法，篩選出優(yōu)異配對抗體。篩選得到的igfbp4配對抗體，單獨或是聯合其他抗體診斷消化道腫瘤，比如結直腸癌時，具有更高的診斷價值。
10、進一步地，所述第一抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.13所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.14所示；所述第二抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.15所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.16所示。
11、另一方面，本發(fā)明提供了一種檢測igfbp4蛋白的試劑盒，所述試劑盒包括如上所述的igfbp4蛋白的抗體。
12、可以理解的是，所述試劑盒可以是elisa檢測試劑盒、化學發(fā)光免疫檢測試劑盒等。
13、在一些方式中，所述試劑盒為化學發(fā)光免疫檢測試劑盒。通過篩選最優(yōu)且合適配對的igfbp4第一抗體和第二抗體，構建雙抗體組合化學發(fā)光免疫檢測試劑盒。
14、再一方面，本發(fā)明提供了一種ccl14蛋白的抗體，包括第一抗體和/或第二抗體；所述第一抗體包括：
15、（1）在重鏈可變區(qū)中的由seq?id?no.17的氨基酸序列組成的cdr1、由seq?idno.18的氨基酸序列組成的cdr2以及由seq?id?no.19的氨基酸序列組成的cdr3，和
16、（2）在輕鏈可變區(qū)中的由seq?id?no.20的氨基酸序列組成的cdr1、由seq?idno.21的氨基酸序列組成的cdr2以及由seq?id?no.22的氨基酸序列組成的cdr3；
17、所述第二抗體包括：
18、（3）在重鏈可變區(qū)中的由seq?id?no.23的氨基酸序列組成的cdr1、由seq?idno.24的氨基酸序列組成的cdr2以及由seq?id?no.25的氨基酸序列組成的cdr3，和
19、（4）在輕鏈可變區(qū)中的由seq?id?no.26的氨基酸序列組成的cdr1、由seq?idno.27的氨基酸序列組成的cdr2以及由seq?id?no.28的氨基酸序列組成的cdr3。
20、本發(fā)明通過優(yōu)化重組ccl14抗原的真核表達工藝，在真核表達系統(tǒng)中表達并純化重組蛋白，大幅提高ccl14的表達量和免疫原性。以純化的重組蛋白為免疫原，免疫小鼠或其他適當的動物，獲得免疫脾臟細胞；采用雜交瘤技術，將免疫脾臟細胞與骨髓瘤細胞進行融合，獲得分泌抗ccl14單克隆抗體的雜交瘤細胞株并從中篩選獲得10株針對ccl14的高親和力、高特異性的單克隆抗體；對篩選獲得的單克隆抗體進行基因克隆、表達和純化，獲得純化的抗體產品。經篩選獲得的抗體，再通過雙抗夾心elisa測試方法，篩選出優(yōu)異配對抗體。篩選得到的ccl14配對抗體，單獨或是聯合其他抗體診斷消化道腫瘤，比如結直腸癌時，具有更高的診斷價值。
21、進一步地，所述第一抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.29所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.30所示；所述第二抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.31所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.32所示。
22、再一方面，本發(fā)明提供了一種檢測ccl14蛋白的試劑盒，所述試劑盒包括如上所述的ccl14蛋白的抗體。
23、可以理解的是，所述試劑盒可以是elisa檢測試劑盒、化學發(fā)光免疫檢測試劑盒等。
24、在一些方式中，所述試劑盒為化學發(fā)光免疫檢測試劑盒。通過篩選最優(yōu)且合適配對的ccl14第一抗體和第二抗體，構建雙抗體組合化學發(fā)光免疫檢測試劑盒。
25、再一方面，本發(fā)明提供了一種檢測igfbp4蛋白和/或ccl14蛋白的試劑盒，所述試劑盒包括如上所述的igfbp4蛋白的抗體，和/或如上所述的ccl14蛋白的抗體。
26、在一些方式中，將檢測igfbp4蛋白的試劑盒和檢測ccl14蛋白的試劑盒進行組合，可用于同時檢測igfbp4蛋白和ccl14蛋白，從而可應用于同時進行多種標志物檢測的領域，比如胃腸道腫瘤診斷領域，通過聯合檢測來提高診斷效能。
27、再一方面，本發(fā)明提供了一種抗體用于制備預測個體是否患有結直腸癌的試劑的用途，所述抗體包括如上所述的igfbp4蛋白的抗體，和/或如上所述的ccl14蛋白的抗體。
28、傳統(tǒng)的單靶向抗體藥物本身存在諸多局限性，現有癌癥診斷技術中，單一生物標志物（如ccl14）檢測存在靈敏度低、假陽性率高的問題。igfbp4雖與腫瘤微環(huán)境相關，但其單獨檢測的臨床應用尚未成熟。本發(fā)明將igfbp4和ccl14作為聯合標志物，通過靶向igfbp4和ccl14蛋白的抗體聯合檢測，解決單一標志物診斷效能不足的問題，提高癌癥診斷的準確性和特異性。
29、igfbp4和ccl14雖然是已知的結直腸癌診斷標志物，但是采用不同的igfbp4抗體和/或ccl14抗體來診斷結直腸癌，其診斷效能存在明顯差異。因為結直腸癌診斷過程中，需要通過igfbp4抗體和/或ccl14抗體來檢測其血液樣品，血液樣品中存在復雜的干擾物質，基質影響較大，容易存在交叉反應，或是一些非線性片段的干擾，直接采用現有的抗體檢測，難以獲得理想的檢測結果，嚴重影響診斷結果的準確性。
30、本發(fā)明經過對抗原的設計、表達、單克隆抗體的篩選，最終獲得的igfbp4、ccl14蛋白的抗體具有更好的檢測靈敏度和特異性，而且信號更穩(wěn)定，交叉反應更小，用于結直腸癌診斷時，能顯著提高診斷效能。
31、進一步地，包括igfbp4蛋白的抗體和ccl14蛋白的抗體。
32、進一步地，所述igfbp4蛋白的抗體包括第一抗體和第二抗體，所述第一抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.13所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.14所示；所述第二抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.15所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.16所示。
33、所述ccl14蛋白的抗體包括第一抗體和第二抗體，所述第一抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.29所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.30所示；所述第二抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.31所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqid?no.32所示。
34、進一步地，所述試劑用于檢測體液樣本中的能與抗體結合的抗原的含量；所述體液樣本包括血液、血漿、血清、淋巴液、腦脊髓液、滑液、尿液、唾液、粘液中的任意一種或多種。
35、在一些實施方式中，所述預測結直腸癌復發(fā)風險的試劑，是以igfbp4、ccl14蛋白為檢測目標制備的檢測試劑，本發(fā)明采用抗體檢測igfbp4、ccl14蛋白。
36、進一步地，所述試劑用于檢測體液樣本中生物標志物的有無或相對豐度或濃度。
37、本發(fā)明從血液篩選到預測結直腸癌復發(fā)風險的生物標志物（igfbp4和ccl14蛋白），這些兩種標志物在結直腸癌患者和健康人群的血液中存在顯著性差異，通過收集血液樣本，即可通過檢測個體血液中igfbp4和ccl14蛋白的含量，從而來預測或輔助診斷該個體患結直腸癌的可能性，或者可以檢測某一群體血液中的igfbp4和ccl14蛋白的含量，進而將該群體分為結直腸癌患者和健康人群。
38、再一方面，本發(fā)明提供了一種預測個體是否患有結直腸癌的試劑盒，所述試劑盒包括如上所述的igfbp4蛋白的抗體，和如上所述的ccl14蛋白的抗體。
39、再一方面，本發(fā)明提供了一種預測個體是否患有結直腸癌的抗體組合，所述抗體組合包括如上所述的igfbp4蛋白的抗體，和如上所述的ccl14蛋白的抗體。
40、進一步地，包括igfbp4蛋白的抗體和ccl14蛋白的抗體。
41、進一步地，所述igfbp4蛋白的抗體包括第一抗體和第二抗體，所述第一抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.13所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.14所示；所述第二抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.15所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.16所示。
42、所述ccl14蛋白的抗體包括第一抗體和第二抗體，所述第一抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.29所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.30所示；所述第二抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.31所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqid?no.32所示。
43、再一方面，本發(fā)明提供了一種預測個體是否患有結直腸癌的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括數據分析模塊，所述數據分析模塊用于分析抗原的檢測值，所述抗原通過抗體進行檢測，所述抗體包括如上所述的igfbp4蛋白的抗體，和/或如上所述的ccl14蛋白的抗體。
44、進一步地，所述數據分析模塊采用已知樣本的標志物的檢測值作為訓練集，根據結直腸癌患者手術后的情況，分為未復發(fā)組、原位復發(fā)組和遠處轉移組，分析未復發(fā)組、原位復發(fā)組和遠處轉移組的檢測值之間的關系，構建模型。
45、進一步地，所述系統(tǒng)還包括數據存儲模塊、數據輸入界面和數據輸出界面；所述數據存儲模塊用于存儲生物標志物的檢測值；數據輸入界面用于輸入生物標志物的檢測值，數據輸出界面用于輸出預測結果。
46、本發(fā)明的有益效果為：
47、1、提供了高效的重組表達igfbp4、ccl14蛋白的方法，其作為免疫原接種實驗動物和試劑盒產品中陽性質控品，本發(fā)明提供的igfbp4、ccl14蛋白具有產量高、穩(wěn)定性好、免疫原性強的特性；
48、2、提供了全新的特異性識別igfbp4抗體序列，可用于構建igfbp4檢測試劑盒，結合雙抗體夾心法設計，交叉反應率極低（<2.0%），靈敏度達ng/ml級別，能高精度檢測igfbp4蛋白；
49、3、提供了全新的特異性識別ccl14抗體序列，可用于構建ccl14檢測試劑盒，結合雙抗體夾心法設計，交叉反應率極低（<3.0%），靈敏度達ng/ml級別，能高精度檢測ccl14蛋白；
50、4、試劑盒單獨或聯合使用在消化道腫瘤中的診斷價值，特別是在腸癌中的診斷價值；采用聯合檢測模型（igfbp4+ccl14邏輯回歸）較單一標志物顯著提升區(qū)分能力（auc≥0.92）。