本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體地，涉及鑒別蘋果汁新鮮度的方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
1、目前，用于檢測(cè)果汁新鮮度的檢測(cè)方法主要采用感官評(píng)定和標(biāo)志物評(píng)定，感官評(píng)定易受到主觀影響，標(biāo)志物評(píng)定依賴特定的標(biāo)志物，難以全面反映新鮮度。
2、如現(xiàn)有技術(shù)cn?105717227?b公開了一種濃縮蘋果汁風(fēng)味品質(zhì)判別方法，采用頂空固相微萃取氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、紫外-高效液相色譜法、柱前衍生-紫外-高效液相色譜法、示差折光-高效液相色譜法對(duì)蘋果汁進(jìn)行分析，得到風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果，采用主成分分析、因子分析綜合打分方法對(duì)果汁的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分類，進(jìn)行主要風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行篩選，用以判別濃縮蘋果汁的風(fēng)味品質(zhì)。但是該技術(shù)篩選出的風(fēng)味物質(zhì)數(shù)量有限，不能更準(zhǔn)確地量化蘋果的新鮮程度。
3、因此，迫切需要開發(fā)一種準(zhǔn)確、便捷、通用的鑒別現(xiàn)榨果汁新鮮度的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：提出一種鑒別蘋果汁新鮮度的方法，該方法通過高分辨質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)，為不同新鮮度蘋果汁的鑒別提供了更為精確的工具。該方法基于指紋圖譜，能夠全面捕捉蘋果汁中小分子代謝物的整體變化，不聚焦于單一指標(biāo)或特定成分的分析，不易受個(gè)別成分影響，檢測(cè)速度快、鑒別準(zhǔn)確度高、模型穩(wěn)定，為相關(guān)行業(yè)監(jiān)管提供了重要的技術(shù)依據(jù)。
2、本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括：
3、本發(fā)明第一方面提供了一種鑒別蘋果汁新鮮度的方法，包括：
4、s1、選擇已知的不同新鮮度的蘋果，包括新鮮蘋果和腐壞蘋果，將不同新鮮度的蘋果分別制成不同新鮮度蘋果汁，利用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)對(duì)所述蘋果汁進(jìn)行分析檢測(cè)，獲得相應(yīng)的指紋圖譜；
5、s2、基于s1所述不同新鮮度蘋果汁相應(yīng)的指紋圖譜的各峰信息作為特征變量，利用k均值聚類分析及正交偏最小二乘法判別分析對(duì)指紋圖譜進(jìn)行聚類和定義，將指紋圖譜定義為新鮮組或腐壞組，得到數(shù)據(jù)集；
6、s3、基于s2所述的數(shù)據(jù)集，采用有監(jiān)督機(jī)器學(xué)習(xí)算法構(gòu)建鑒別模型；
7、s4、取待測(cè)未知蘋果汁，采用s1同樣的檢測(cè)條件得到未知蘋果汁的指紋圖譜，基于s3所述鑒別模型，鑒別未知蘋果汁的新鮮度。
8、在一些實(shí)施例中，所述s2步驟后還包括：基于s1所述的指紋圖譜，采用正交偏最小二乘判別分析對(duì)s1所述不同新鮮度蘋果汁數(shù)據(jù)進(jìn)行差異變量提取，結(jié)合s-plot分析與vip評(píng)分篩選出具有顯著差異的標(biāo)志物，基于標(biāo)志物，輔助驗(yàn)證所述鑒別模型的結(jié)果。
9、在一些實(shí)施例中，所述s1步驟中所述不同新鮮度蘋果汁經(jīng)過溶劑提取后得到提取液，利用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)對(duì)提取液進(jìn)行分析檢測(cè)，所述溶劑提取包括超聲輔助提取，所述溶劑為包括甲醇、乙醇、丙醇、乙酸乙酯、乙腈、甲醇或水中的一種或多種的混合溶液。
10、在一些實(shí)施例中，所述溶劑由乙腈、甲醇和水的混合溶液組成，所述乙腈、甲醇和水的體積比為(0.5-2):(0.5-2):2。
11、在一些實(shí)施例中，所述s2利用k均值聚類分析及正交偏最小二乘法判別分析對(duì)所述指紋圖譜進(jìn)行聚類和定義步驟包括：
12、s2-1、通過k均值聚類分析對(duì)所述指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行無監(jiān)督分組，計(jì)算聚類數(shù)為2-8時(shí)的輪廓系數(shù)和戴維斯-博爾丁指數(shù)，綜合參考輪廓系數(shù)和戴維斯-博爾丁指數(shù)，優(yōu)先選擇輪廓系數(shù)高于0.1的聚類數(shù)量的組，并在前述輪廓系數(shù)高于0.1的組中選擇戴維斯-博爾丁指數(shù)最低的組對(duì)應(yīng)的聚類數(shù)量作為最佳聚類數(shù)量；
13、s2-2基于k均值聚類結(jié)果，采用正交偏最小二乘法判別分析進(jìn)行分析，通過交叉驗(yàn)證方差分析驗(yàn)證模型顯著性，篩選出f統(tǒng)計(jì)量最大且 p值最小的組別劃分方案，將不同放置程度蘋果汁定義為新鮮組或腐壞組。
14、在一些實(shí)施例中，所述s4步驟包括：
15、s4-1、將所述待測(cè)未知蘋果汁的指紋圖譜輸入所述鑒別模型，通過所述鑒別模型內(nèi)置的線性決策邊界計(jì)算其分類概率；
16、s4-2、基于預(yù)設(shè)概率閾值判定s4-1所述數(shù)據(jù)為新鮮組或腐壞組，概率閾值≥0.8判定為新鮮組，概率閾值≤0.2判定為腐壞組，若概率值介于0.2-0.8之間，則通過重復(fù)檢測(cè)或引入輔助指標(biāo)進(jìn)行二次驗(yàn)證。
17、在一些實(shí)施例中，所述色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)采用的色譜檢測(cè)條件為：
18、色譜柱：waters?acquity?uplc?beh?c18色譜柱，規(guī)格：2.1×100?mm，1.7?μm；流動(dòng)相a：甲醇；流動(dòng)相b：0.1%甲酸-水溶液；流速：0.2?ml/min；進(jìn)樣體積：2?μl；柱溫：40?℃，
19、所述色譜采用梯度洗脫，所述梯度洗脫條件包括：起始，流動(dòng)相a：2%；0-10分鐘，流動(dòng)相a：2-50%；10-14分鐘，流動(dòng)相a：50-98%；14-17分鐘，流動(dòng)相a：98%；17-17.1分鐘，流動(dòng)相a：98-2%；17.1-20分鐘，流動(dòng)相a：2%；
20、和/或，所述色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)的質(zhì)譜檢測(cè)條件為：
21、掃描模式：全掃描+二級(jí)碎裂，正負(fù)離子切換；分辨率：一級(jí)70000，二級(jí)15000；毛細(xì)管溫度：350?℃；輔助氣溫度：320?℃；鞘氣流量：40?arb；輔助氣體流量：10?arb；s-lens?rf電壓：55?v；噴霧電壓：+3.2?kv或-3.0?kv；掃描范圍：m/z?70-1050?da。
22、在一些實(shí)施例中，所述有監(jiān)督機(jī)器學(xué)習(xí)算法選自以下算法中的任意一種：隨機(jī)森林、k近鄰、支持向量機(jī)、線性判別分析、正交偏最小二乘-判別分析或線性支持向量機(jī)。
23、在一些實(shí)施例中，所述標(biāo)志物包括：4-胍基丁醛、胞嘧啶、硫酸膽堿、馬來酸酯、松柏醇、磺基丙酮、乙酰-l-肉堿、泛醇、4-（2-氨基苯基）-2,4-二氧代丁酸酯、l-次甘氨酸、4-亞甲基-l-谷氨酸、腺苷、2,3-二氫-3-羥基-2-氧代-1h-吲哚-3-乙酸甲酯、3-（3,4-二羥基苯基）乳酸、咖啡酸3-葡萄糖苷中的一種或多種。
24、本發(fā)明第二方面公開了一種鑒別蘋果汁新鮮度的試劑盒，包括（a）數(shù)據(jù)分析模塊，所述（a）數(shù)據(jù)分析模塊包括數(shù)據(jù)分析u盤，所述數(shù)據(jù)分析u盤包括如下（a-1）~（a-3）：
25、（a-1）基于本發(fā)明第一方面所述的有監(jiān)督機(jī)器學(xué)習(xí)算法構(gòu)建的鑒別模型；
26、（a-2）自動(dòng)化執(zhí)行數(shù)據(jù)矯正、分箱、歸一化的數(shù)據(jù)預(yù)處理r腳本；
27、（a-3）自動(dòng)化調(diào)用鑒別模型，執(zhí)行未知樣品鑒別和結(jié)果輸出的python；或者，所述試劑盒包括所述（a）數(shù)據(jù)分析模塊和如下（b）~（e）模塊：
28、（b）前處理耗材模塊，所述前處理耗材模塊包括濾膜和高速離心管；
29、（c）溶劑模塊，所述溶劑模塊包括溶劑，所述溶劑與本發(fā)明第一方面所述的s1中的提取溶劑一致，用于獲得未知蘋果汁樣品的提取液，并基于所述提取液利用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行分析檢測(cè)，所述溶劑為乙腈、甲醇和水的混合溶液，體積比0.5-2:0.5-2:2；
30、（d）內(nèi)標(biāo)模塊，所述內(nèi)標(biāo)模塊包括2-氯-l-苯丙氨酸；
31、（e）操作指南模塊，包括標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)流程及故障排查方案。
32、本發(fā)明至少具有以下的有益效果：
33、（1）本發(fā)明采用高分辨質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法，基于指紋圖譜基礎(chǔ)系統(tǒng)分析了蘋果汁隨放置時(shí)間增加在腐壞過程中的化學(xué)成分變化，能夠?qū)?fù)雜的化學(xué)成分進(jìn)行全面、無偏的捕捉，并揭示出蘋果汁樣品在不同腐壞程度下的細(xì)微差異，無需預(yù)先設(shè)定假設(shè)，具有較高的靈敏度和廣泛的應(yīng)用性。基于指紋圖譜基礎(chǔ)系統(tǒng)通過k均值聚類分析（k-means?clustering）及正交偏最小二乘法判別分析（opls-da）對(duì)不同放置時(shí)間的蘋果汁進(jìn)行聚類并定義新鮮和腐壞，通過線性支持向量機(jī)（linear?svm）建立了鑒別模型，利用該模型能夠成功實(shí)現(xiàn)新鮮和腐壞現(xiàn)榨蘋果汁的區(qū)分。由此，該方法檢測(cè)速度快、鑒別準(zhǔn)確度高、模型穩(wěn)定，提升了現(xiàn)榨蘋果汁新鮮度鑒別的效率和準(zhǔn)確性，為相關(guān)行業(yè)監(jiān)管提供了重要的技術(shù)依據(jù)。
34、（2）本發(fā)明提供了一種鑒別蘋果汁新鮮度的試劑盒。利用該試劑盒鑒別蘋果汁新鮮度，操作簡(jiǎn)單、分析時(shí)間短、僅需微量樣品即可進(jìn)行檢測(cè)，并且無需或僅需很少的預(yù)處理、樣品損失少，檢測(cè)速度快，靈敏度和準(zhǔn)確度高。