用于化學合成的自動氣體閥容器支座的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種容器支座10，包括主體12，主體12繼而包括氣體入口16；溶液液體出口18；氣體控制閥20，氣體通過其從氣體入口進入容器100；以及用于容器的密封器件22，該密封器件包括用于氣體的輸入和容器中的溶液經由流出管19的輸出的通路24；其中當容器通過密封器件連接到容器支座時，氣體控制閥自動地開啟，且當容器斷開時，氣體控制閥自動地關閉。本發明還涉及包括兩個或更多容器支座的容器面板50。還公開了使用這些容器和容器面板以用于合成多肽的方法。
【專利說明】
用于化學合成的自動氣體閥容器支座
技術領域
[0001] 本發明涉及化學合成，諸如肽合成、蛋白質生物合成，或低聚核苷酸合成。更具體 而言，本發明涉及用于此類合成所需的溶液的自動氣體閥容器支座，以及使用此自動氣體 閥容器支座的合成的方法。
【背景技術】
[0002] 在近幾年間，肽療法（不包括胰島素）呈兩位數的增長。一旦解決穩定性（擱置壽 命)和在體內快速降解的問題，則肽療法的成功就拉開序幕。在預先的臨床前和臨床發展階 段，進行了幾百次嘗試。相比于二十世紀八十年代的5種新API(藥用活性成分)/每年，2010 年幾乎20種新API進入了臨床研究。合成肽構成了銷售的肽和儲備中的肽的大部分(大約 70%)。肽研究和制造在全球展開，但歐洲和美國市場占據了肽API的5億美元/年的總體估計 的可尋的市場機會的較大部分。
[0003] 使用肽作為藥品中的API的好處已經被認識了幾十年，但還未開發至其全部能力。 已經認識到了許多功能，但一直在探索新的治療領域和適應癥。相比于傳統小分子，肽的優 點在于其高度靶專一性、高效力和低毒性。所有的降解產物是氨基酸，其最大程度減小系統 毒性的任何風險，且其短t 1/2(半衰期)消除了累積在組織中的較高風險。體內的肽的穩定性 和短t1/2的挑戰已經在較大程度上得到滿足。
[0004] 若干合成技術可用于多肽的制造。簡化且簡要的概述在表1中提出。所需的量、肽 的長度和其復雜性影響選擇。可開發出混合版本以使用各個獨立技術的優點。在混合版本 中，肽片段使用固相技術合成，且這些鏈接在一起以使用批量合成糾正整個長度的產品。
[0005] 表1肽制造技術
不同于低聚核苷酸的合成，除其它化學溶液之外，多肽合成系統需要能夠處理20種以 上不同的氨基酸。此外，有機溶劑中的氨基酸需要與空氣水分分離，因為它們對水敏感。因 此，所需的是提供這些期望特征的緊湊容器支座。
【發明內容】
[0006] 本文所公開的包括一種新穎容器支座，其包括氣體閥，氣體閥在容器連接到容器 支座時自動地開啟。當容器斷開時，氣體控制閥自動地關閉。還公開了包括至少兩個公開的 容器支座的容器支座面板，以及使用此容器支座和容器支座面板來供應一種或多種氨基酸 的化學合成的方法。
[0007] 因此，本發明的第一方面在于提供一種容器支座，其包括主體，主體繼而包括： (a) 氣體入口； (b) 溶液出口； (c) 氣體控制閥，通過其允許氣體從氣體入口進入容器;以及 (d) 用于密封使用中的容器的密封器件，該密封器件包括用于氣體的輸入和用于容器 中的溶液的流出的通路； 其中，當容器通過密封器件密封地連接到容器支座時，氣體控制閥自動地開啟，且當容 器與容器支座流體地斷開時，氣體控制閥自動地關閉。
[0008] 本發明的第二方面在于提供一種容器支座面板，包括根據本發明的第一方面的兩 個或更多容器支座。
[0009] 本發明的第三方面提供了一種用于化學合成例如多肽的方法，包括合成步驟的循 環： (a) 對現有肽上的α氨保護基去保護； (b) 從氨基酸的供應對混合器中的下一氨基酸預活化;以及 (c) 將活化的氨基酸耦合至現有肽； 其中至少一種氨基酸通過連接到根據本發明的某些方面的容器支座的容器供應。
[0010] 本發明的另一個方面提供了一種用于合成多肽的方法，包括合成步驟的循環： (a) 對現有肽上的α氨保護基去保護； (b) 從氨基酸的供應對混合器中的下一氨基酸預活化;以及 (c) 將活化的氨基酸耦合至現有肽； 其中至少一種氨基酸通過連接到根據本發明的某些方面的容器支座面板的容器供應。
[0011] 本發明的進一步細節和優點將從以下描述和權利要求中出現。
【附圖說明】
[0012] 圖1示出了就位的容器支座和容器的截面視圖。氣體通過具有外徑1/16英寸 (1.6_)的毛細管供應，且類似的毛細管用作用于氨基酸的出口。
[0013] 圖2示出了容器支座的局部截面側視圖。彈簧閥將通過其內部0形環密封。
[0014] 圖3示出了截面側視圖。彈簧閥開啟，且氣體將加壓容器。
[0015] 圖4示出了截面前視圖。導銷防止鋼盤在管連接時關于其螺紋旋轉。
[0016] 圖5示出了帶有臺架支撐物的示例性容器支座。
[0017] 圖6示出了附接到原型多肽合成器的柜軌道的示例性容器支座。
【具體實施方式】
[0018] 對于多肽合成系統的一個要求涉及除其它化學溶液之外，需要能夠處理20種以上 不同的氨基酸。此外，有機溶劑中的氨基酸需要與氣濕分離，因為它們對濕氣敏感。設計了 一種新穎容器支座，其包括氣體閥，氣體閥在容器連接到容器支座時自動地開啟。當容器斷 開時，氣體控制閥自動地關閉。此容器支座確保了在包括對于外部環境敏感的成分的容器 附接到容器支座時，小壓力累積在容器中，因此該成分與外部環境分離。本發明還提供了包 括至少兩個公開的容器支座的容器支座面板，以及使用此容器支座或容器支座面板來供應 一種或多種氨基酸的肽合成方法。
[0019] 第一方面，本發明涉及如圖1中示范的用于保持容器100的容器支座10。支座10包 括主體12，其具有面向下的內螺紋孔口 14以用于接納容器100的互補的帶螺紋的上部110。 容器支座主體12還包括氣體入口 16;液體溶液出口 18;氣體控制閥20，空氣經由其從氣體入 口 16進入容器100;以及用于在容器擰入支座主體10中時密封容器的密封器件22,該密封器 件包括用于氣體的輸入和用于流出管19的通路24,管19從容器100傳送輸出液體L溶液。流 出管19浸入容器中的液體L中，使得來自氣體入口 16的氣壓將迫使液體L沿流出管19向上行 進并離開出口 18。當容器連接到容器支座時，氣體控制閥20自動地開啟，且當容器斷開時， 氣體控制閥自動地關閉。
[0020] 氣體閥的操作在圖2和圖3中更詳細示出，其中圖2示出了支座的主體12，其中無附 接到其上的相應的容器，使得氣體閥20關閉，且圖3示出了其中附接了容器的主體，使得氣 體閥20開啟。
[0021] 更詳細而言，當容器100未擰入就位時（圖2)，閥20的彈簧推動的銷28被向下推動， 使得入口 16中的氣體G受阻且不可行進經過阻擋室26。當容器100擰入就位時，容器的上緣 120作用于彈性體平密封部件23上，其繼而向上推動閥促動板27以作用在閥銷29上，且相對 于其彈簧推動向上推動銷。閥20然后打開，且允許氣體加壓容器1〇〇。板27的后部通過0形環 密封件25相對于主體12密封。
[0022] 圖3中可看到的是，通路24容納加壓氣體G的流和流出管19兩者，提供了容易清潔 的簡單構造的帽。
[0023] 在一個實施例中，氣體控制閥20為彈簧閥。
[0024] 在一個實施例中，密封器件包括螺紋部分14和板27或盤，其中當容器通過其帶螺 紋的上緣120或蓋與螺紋部分連接時，板27或盤開啟氣體控制閥20。板27或盤可由鋼或塑料 制成。
[0025] 在某些實施例中，容器支座還包括板27或盤下方的平密封件23,以及板/盤與主體 的內側表面或邊緣之間的0形環25。
[0026] 圖4示出了穿過不同截面截取的主體12的另一個截面視圖。在此視圖中，導銷30示 為由引導彈簧31推入就位。導銷30的目的在于在容器100擰入主體12中的位置時阻止板27 旋轉。
[0027] 在某些實施例中，結合容器支座使用的容器可為任何形狀或尺寸，只要螺紋110匹 配容器支座的螺紋14。作為備選，具有用于不同容器的不同螺紋的適配器構件可用于將不 同容器連接到不同容器支座。在優選實施例中，容器為50ml的管，諸如Falcon管。
[0028] 容器支座設計成使得當氣體控制閥處于開啟位置時，容器利用惰性氣體加壓，且 容器中的溶液與外部環境隔離。在某些實施例中，惰性氣體可為無濕氣的。在某些其它實施 例中，惰性氣體為氮。
[0029] 本發明的第二方面在圖5和圖6中示出。示出了容器支座50,其包括保持多個容器 100的改進的容器支座。改進的容器支座10'具有多個接納容器的螺紋孔口 14'、公共氣體入 口 16'和多個出口 18。在圖5中，示出了4個容器支座10'，其一個在另一個上方安裝在垂直支 撐物55上，以形成容器支座面板50。
[0030] 在另一個示例性實施例中，本發明涉及包括至少兩排容器支座的容器支座面板 50，各排具有至少兩個容器支座。在優選實施例中，容器支座面板包括四排容器支座，各排 具有8個容器支座。
[0031] 在一個實施例中，各個容器支座的氣體入口連接到公共氣源。
[0032]圖6示出了結合化學合成(諸如多肽合成)的設備使用的面板50。
[0033] 在某些實施例中，容器支座面板用于將氨基酸溶液供應到肽合成器60。在某些優 選實施例中，容器支座面板50用于將多肽合成運行所需的所有氨基酸溶液供應到肽合成器 60 〇
[0034] 在本發明的另一個方面，提供了一種用于合成多肽的方法，包括合成步驟的循環： (a) 對現有肽上的α氨保護基去保護； (b) 從氨基酸的供應對混合器中的下一氨基酸預活化;以及 (c) 將活化的氨基酸耦合至現有肽； 其中至少一種氨基酸通過連接到根據本發明的方面的容器支座的容器供應。在一個示 例性實施例中，各種氨基酸通過連接到容器支座的獨立容器供應。
[0035] 在本發明的第三方面，提供了一種用于合成多肽的方法，包括合成步驟的循環： (a) 對現有肽的α氨保護基去保護； (b) 從氨基酸的供應對混合器中的下一氨基酸預活化;以及 (c) 將活化的氨基酸耦合至現有肽； 其中至少一種氨基酸通過連接到根據本發明的方面的容器支座面板的容器支座的容 器供應。在一個示例性實施例中，各種氨基酸通過連接到容器支座面板的容器支座的容器 供應。
[0036] 下文簡要描述了用于多肽合成的循環過程。
[0037]示例性多肽合成過程 多肽可在裝填在柱中的固體支撐物上合成。所需的柱容積CV與支撐物的膨脹性質以及 將產生的肽的量/長度有關。支撐物可以以干形式或作為漿料在設置系統之前加入柱中。合 成過程是循環程序，其中各個循環將一種氨基酸加入生長的肽鏈。第一氨基酸(AA)可能已 經附接到準備用于待耦合的第二AA的支撐物上的α-氨反應部位。對于各個循環，不同的化 學制品/試劑以逐步方式栗送穿過裝填的柱。
[0038] (1)合成步驟 各個循環包括： ?對柱中現有肽上的α胺保護基去保護 ?對混合器中的下一氨基酸預活化 ?利用穿過柱的再循環使預活化的氨基酸耦合 ?可選的封端步驟以阻止氨基酸鏈末端的未結合的氨基酸在所有隨后合成步驟中結合 至任何氨基酸。
[0039]各個循環中的獨立步驟后接清洗通路和柱來消除任何交叉污染和不期望的反應。 循環重復，直到產生期望的多肽產物(氨基酸鏈）。
[0040]在開始時，AA的預期序列與信息一起輸入軟件中，諸如將使用的固體支撐物、對于 各個AA耦合期望的活化和耦合混合物，以及活化和耦合分別所需的時間。
[0041] 1.現有肽的最后的AA的去保護將除去Fmoc保護基。這通過加入與溶劑(通常是NMP 或DMF)混合的去保護劑(例如，哌啶)來完成。沖洗柱，且混合物通過廢物除去。N端現在與需 要活化的下一AA自由反應。
[0042] 通路、柱和混合器利用溶劑清洗(通常是NMP或DMF)。
[0043] 2.將耦合至生長的肽的下一 AA的預活化在混合器中執行。添加劑和基料（如果對 于待活化的AA需要)與預期的AA和耦合劑CR-起加入混合物中。存在添加劑、基料和CR試劑 的備選物，且選擇取決于特定AA和將產生的耦合。
[0044] 3.預活化的氨基酸的耦合通過經由柱栗送耦合混合物來執行。該反應較慢，且對 于高耦合程度需要再循環。
[0045] 該步驟后接清洗通路、柱和清潔混合器至預活化的AAS0.01%的檢測水平。
[0046] 取決于待執行的耦合，任何未反應的α胺部位有時需要在加入下一 AA之前消除。出 于此目的，封端劑因此可選地通過柱沖洗。
[0047] 合成循環對于下一 ΑΑ耦合繼續。
[0048] (2)合成后 當合成完成時，柱從系統拆卸。使材料干燥，且肽隨后在過濾/凈化之前從支撐物裂開。 粗肽已經裂開之后仍存在的支撐物棄置，因為其為一次性使用的材料。 容器支座 各種氨基酸溶解于有機溶劑中，且需要受保護而免受氣濕。這通過以較小超壓來加壓 保持ΑΑ溶液的容器實現，以確保沒有空氣泄漏到容器中，因為其在肽合成過程期間排空。容 器的加壓通過將具有氣體入口的容器連接在瓶支座上且然后將惰性氣體分布到容器中來 實現。氣流通過彈簧閥限制，以確保在瓶除去時沒有氣體泄漏。當瓶完全附接時，彈簧閥的 開口匹配氣體入口，且氣體自由流入瓶中。圖1。
[0049] 用于ΑΑ的容器支座對于具有良好使用性和確保正確功能性很重要。使用性問題于 容器以有效且穩健的方式與流動通路附接和除去有關。功能性主要關于保持ΑΑ免受濕氣的 需要，但由于ΑΑ溶液中的高粘性，故在入口管中具有一定超壓來防止成穴也可能較好。
[0050] 容器支座的主體配備有氣體控制閥，其在容器完全連接時打開（圖2)，且在容器斷 開時關閉（圖3)。
[0051] 當容器與容器支座連接時，鋼盤接合彈簧閥以打開氣體入口，且氣體通過鋼盤中 的超過尺寸的孔進入容器用于溶液出口。流入管中的氣體由圖2中的綠色虛線箭頭示出。0 形環和平橡膠密封件可用于防止氣體泄漏，見圖2中的紅色和藍色虛線圓。手指上緊的1/16 英寸連接器(GE Healthcare)可用于氣體入口和氨基酸出口來防止氣體泄漏。
[0052]當容器并未與容器支座緊密連接時，鋼盤將通過重力和彈簧閥內的內部彈簧力下 落。彈簧閥將通過其內部〇形環密封，圖3。圖1-圖4中所示的彈簧閥為常用于汽車輪胎的示 例性Schrader閥。
[0053]可選地，兩個圓柱形導銷附接在鋼盤上，這防止其旋轉，否則這將引起用于氨基酸 出口毛細管的超過尺寸的孔位置不當（圖4)。導銷可設有其自身的螺旋彈簧，以因而支撐彈 簧閥的內部彈簧(即，確保閥盤的適當返回）。
[0054] 在容器就位時，圖1-圖4中所述的自動氣體控制系統通過減少氣體消耗和確保氣 流來提供附加價值。利用正確尺寸的連接，任何容器都可結合容器支座使用。優選容器為 Falcon 50ml管。
[0055] 結合多肽合成器使用的容器支座面板 大部分多肽由許多不同的氨基酸組成。因此，肽合成器可能需要能夠在單次多肽合成 運行中接收20種或更多種氨基酸。因此，對于各個合成運行可能需要20個或更多容器支座。 替代單個容器支座，因此期望使用支座面板，以較好地組織氨基酸和其它溶液，且最大限度 減少合成過程的人為干預。
[0056] 因此，容器支座面板可包括兩個或更多容器支座。在一個示例中，容器支座由用于 標準50ml Falcon管的32個位置和10個手指上緊的1/16英寸連接(面板的任一側上5個)組 成，以用于將惰性氣體(例如，N2)供應至外部較大的容器。用于Falcon管的32個位置獨立地 配備有氣體控制閥，其在管連接時打開，且在管斷開時關閉。氣體管可整體結合在容器面板 壁中，作為壁的一部分，或在容器面板的相對側上。氣體管可在任何位置，只要其不干擾容 器。
[0057] 容器與對應的容器支座連接可通過將容器的蓋上的螺紋與容器支座的對應螺紋 部分螺紋連接來實現。因此，在一個實施例中，容器支座面板的一些容器支座可具有不同類 型的螺紋以用于接納不同的容器。在另一個實施例中，容器支座面板中的容器支座具有相 同類型的螺紋，且具有用于不同容器的不同螺紋的適配器構件可用于將不同容器連接到容 器支座面板中的支座。
[0058] 容器支座面板可為具有支撐部件的獨立單元（圖5)，或置于柜軌道上（圖6)。
[0059] 連接到獨立容器支座或容器支座面板的氣體入口的容器可使用惰性氣體(諸如 N2)以大約0.1到大約0.5bar加壓。盡管50ml Falcon管對于容器支座面板是優選的，但達到 200ml的容器可用于實驗室規模的多肽合成器。為了最大限度減少重量和交叉污染的可能 性，高度耐化學制品的塑料的單次使用的管可為優選的。
[0060] 盡管已經示出和描述了本發明的特定實施例，但本領域的技術人員將清楚的是， 可制作出變化和改型而不脫離本發明的教導內容。例如，本文已經列舉了多肽合成，但本領 域的技術人員將清楚的是，所述和所示的容器支座將在其它合成技術中具有廣泛的適用 性，諸如蛋白質或低聚核苷酸的合成。前述描述和附圖中闡釋的主題僅通過圖示提供而不 作為限制。在基于現有技術以其適合的觀點查閱時，本發明的實際范圍意在限定于以下權 利要求中。
【主權項】
1. 一種容器支座（10; 10 '），包括主體（12)，所述主體（12)繼而包括 (a) 氣體入口（16); (b) 溶液出口（18); (c) 氣體控制閥(20 )，其允許氣體從所述氣體入口進入所述容器；以及 (d) 用于密封使用中的所述容器的密封器件（22)，所述密封器件包括用于所述氣體的 輸入和用于所述容器中的液體的流出的通路(24); 其中，當所述容器通過所述密封器件密封地連接到所述容器支座時，所述氣體控制閥 自動地開啟，且當所述容器與所述容器支座斷開時，所述氣體控制閥自動地關閉。2. 根據權利要求1所述的容器支座，其特征在于，所述氣體控制閥為可借助于板(27)操 作的彈簧閥，所述板(27)繼而由將所述容器密封地連接到所述容器支座的動作移位。3. 根據權利要求1所述的容器支座，其特征在于，所述主體包括內螺紋孔口（14)，且其 中所述密封器件包括與所述螺紋孔口互補的螺紋部分和板，其中當所述容器與所述螺紋部 分連接時，所述板開啟所述氣體控制閥。4. 根據權利要求2或權利要求3所述的容器支座，其特征在于，所述板包括用于使所述 容器和所述入口流體地互連的通路24,且所述出口包括用于延伸到所述容器中的流出管 (19)，所述通路容納所述管。5. 根據權利要求3所述的容器支座，其特征在于，所述容器支座包括盤下方的平密封 件，以及所述盤與所述孔口的內表面之間的〇形環。6. 根據權利要求3所述的容器支座，其特征在于，所述容器支座還包括可與所述板一起 操作以防止所述板旋轉的一個或多個導銷(30)。7. 根據權利要求6所述的容器支座，其特征在于，所述容器支座還包括用于將所述導銷 推入可操作位置的螺旋彈簧。8. 根據權利要求1所述的容器支座，其特征在于，所述容器中的至少一些為50ml的管。9. 根據權利要求1所述的容器支座，其特征在于，當所述氣體控制閥在開啟位置時，所 述容器可利用惰性氣體加壓，且所述容器中的溶液與其外部環境隔離。10. 根據權利要求9所述的容器支座，其特征在于，所述惰性氣體為無濕氣的。11. 根據權利要求9所述的容器支座，其特征在于，所述惰性氣體為氮。12. 根據權利要求1所述的容器支座，其特征在于，所述容器支座用于將氨基酸溶液(L) 供應至合成器，諸如肽或低聚核苷酸合成器。13. -種容器支座面板(50)，包括前述權利要求中任一項所述的兩個或更多容器支座 (10，）。14. 根據權利要求13所述的容器支座面板，其特征在于，所述容器支座面板包括至少兩 排容器支座，各排包括至少兩個容器支座。15. 根據權利要求13所述的容器支座面板，其特征在于，所述容器支座面板包括四排容 器支座，各排包括8個容器支座。16. 根據權利要求13所述的容器支座面板，其特征在于，各個容器支座的氣體入口連接 至公共氣源（16'）。17. 根據權利要求13所述的容器支座面板，其特征在于，所述容器支座面板用于將一種 氨基酸溶液供應至肽合成器。18. 根據權利要求13所述的容器支座面板，其特征在于，所述容器支座面板用于將所有 氨基酸溶液供應至肽合成器。19. 一種用于合成多肽的方法，包括合成步驟的循環： (a) 對現有肽上的α氨保護基去保護； (b) 從氨基酸的供應對混合器中的下一氨基酸預活化；以及 (c) 將活化的氨基酸耦合至現有肽； 其中至少一種氨基酸通過連接到權利要求1至權利要求12中任一項所述的容器支座或 根據權利要求13至權利要求18中任一項所述的容器支座的容器供應。20. 根據權利要求19所述的方法，其特征在于，所述氨基酸或各種氨基酸通過連接到容 器支座或容器支座面板的相應容器供應。21. -種用于合成多肽的方法，包括合成步驟的循環： (a) 對現有肽上的α氨保護基去保護； (b) 從氨基酸的供應對混合器中的下一氨基酸預活化；以及 (c) 將活化的氨基酸耦合至現有肽； 其中至少一種氨基酸通過連接到權利要求13所述的容器支座面板的容器支座的容器 供應。22. 根據權利要求17所述的方法，其特征在于，各種氨基酸通過連接到所述容器支座面 板的容器支座的容器供應。
【文檔編號】C07K1/00GK106068230SQ201580013042
【公開日】2016年11月2日
【申請日】2015年3月12日 公開號201580013042.1, CN 106068230 A, CN 106068230A, CN 201580013042, CN-A-106068230, CN106068230 A, CN106068230A, CN201580013042, CN201580013042.1, PCT/2015/55244, PCT/EP/15/055244, PCT/EP/15/55244, PCT/EP/2015/055244, PCT/EP/2015/55244, PCT/EP15/055244, PCT/EP15/55244, PCT/EP15055244, PCT/EP1555244, PCT/EP2015/055244, PCT/EP2015/55244, PCT/EP2015055244, PCT/EP201555244
【發明人】B.M.奧洛夫森, M.奧斯馬克, M.加姆伯格, D.卡爾遜
【申請人】通用電氣健康護理生物科學股份公司