本發明涉及膠體金制備，尤其是涉及一種單分散免疫檢測用膠體金及其制備與應用。
背景技術：
1、膠體金是一種在溶液中具有穩定分散性質的膠體溶液，其主要組分是具有一定形態和尺寸且表面帶有負電荷的金納米顆粒，這些金納米顆粒是氯金酸在還原劑(如白磷、抗壞血酸、過氧化氫、硼氫化鈉、枸櫞酸鈉和鞣酸等)的作用下被還原成金原子進而聚集而成的納米顆粒，對蛋白質具有很強的吸附性，可以將蛋白質牢固地結合在顆粒表面，且無論是在液態還是固態形式，都能夠長期穩定保持蛋白質固有的生物活性，同時膠體金顯色明顯，因此膠體金被廣泛用于醫學檢驗的快速診斷領域。
2、膠體金的形貌和尺寸會影響膠體金與蛋白質的相互作用，進而影響免疫檢測產品的各項性能。小尺寸膠體金比表面積大與生物分子的偶聯效率高，但是顯色效果較差。大尺寸膠體金顯色效果好，但是偶聯效率相對較低。而尺寸在20～60nm之間的膠體金能夠同時兼顧偶聯效率和顯色效果的檢測要求。此外膠體金形貌不均一或粒徑不均勻，會導致標記蛋白質的膠體金復合物不能穩定保存，進而產生層析不完全、本底過高或出現假陽性等結果。
3、目前常見的膠體金制備方法是一步還原法，使用不同類型的還原劑可以制備出粒徑在1～200nm的膠體金。眾多還原劑中最常用的還原劑是檸檬酸鈉，frens等保持氯金酸用量不變，調節檸檬酸鈉用量，即改變檸檬酸鈉與au3+的摩爾比，即可得到不同粒徑的膠體金，一步還原法操作簡單，適合大規模生產制備，是目前最常用的膠體金制備方法。一般來說，該方法控制檸檬酸鈉與au3+的摩爾比在2.8～1:5之間，可以制備粒徑在10～60nm的膠體金，尤其適合制備粒徑在15～30nm的球形單分散膠體金。但是該方法存在幾個問題，首先隨著檸檬酸鈉與au3+的摩爾比減小時，制備的膠體金形貌趨向于不規則(橢圓、三角形等)且金納米顆粒的單分散性逐漸下降；其次，合成大粒徑膠體金時，隨著檸檬酸鈉用量減少，反應體系的ph值逐漸趨向于酸性，導致金納米顆粒表面電荷下降，進而導致膠體金穩定性變差；最后，frens法中氯金酸濃度通常較低(～0.25mm)，導致膠體金中金納米顆粒濃度相對較低，為了提升產量而擴大反應規模，需要耗費大量人力和物力。
4、綜上，現有技術很難制備出粒徑在20～60nm，同時滿足穩定性好、球形單分散且顆粒濃度高的膠體金，需要提出新的膠體金合成方法。
技術實現思路
1、為了解決上述問題，本發明的目的是提供一種單分散免疫檢測用膠體金及其制備與應用。本發明以檸檬酸鈉為還原劑，通過調節氯金酸水溶液的ph值和反應溫度來調控金納米顆粒的生長路徑進而得到穩定性好、球形單分散且金納米顆粒濃度高的膠體金。
2、本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：
3、本發明的第一個目的是提供一種單分散免疫檢測用膠體金的制備方法，包括以下步驟：
4、(s1)將氯金酸與去離子水混勻，后處理得到第一混合溶液；
5、(s2)將步驟(s1)制備得到的第一混合溶液升溫后加入檸檬酸鈉，反應后后處理得到球形的單分散免疫檢測用膠體金。
6、在本發明的一個實施方式中，步驟(s1)中，所述氯金酸與去離子水的用量比為0.05～0.25mmol：100ml。
7、在本發明的一個實施方式中，步驟(s1)中，所述后處理為利用ph調節劑調節ph值至2.5～5。
8、在本發明的一個實施方式中，所述ph調節劑選自鹽酸、氫氧化鈉或三(羥甲基)氨基甲烷中的一種。
9、在本發明的一個實施方式中，步驟(s2)中，檸檬酸鈉與氯金酸的摩爾比為2～10：1。
10、在本發明的一個實施方式中，步驟(s2)中，反應過程中，溫度為75～95℃，反應至溶液顏色不變。
11、在本發明的一個實施方式中，步驟(s2)中，所述后處理為攪拌冷卻至室溫后低溫避光保存。
12、在本發明的一個實施方式中，單分散免疫檢測用膠體金處于2～8℃下避光保存。
13、本發明的第二個目的是提供一種通過上述方法制備得到的單分散免疫檢測用膠體金。
14、本發明的第三個目的是提供一種單分散免疫檢測用膠體金在免疫檢測中的應用。
15、本發明通過調節反應溫度和ph調節劑調節反應溶液體系的ph值來代替改變檸檬酸鈉的濃度來控制膠體金的粒徑。基本上，化學反應速率很大程度上取決于溫度，所以相對較低的反應溫度可以降低金納米顆粒的生長速率。反應體系ph值的改變則會引起反應溶液中氯金酸的反應速率和檸檬酸鈉水解產物結構的改變，進而能夠顯著提高膠體金的粒徑單分散性和金納米顆粒的穩定性。當ph值低于6.2時，溶液中au3+配合物只有一個oh-配體，其反應活性非常高，此時金納米顆粒的形成包括三個連續的過程，即成核、非定向吸附(或聚集)和粒子內熟化，導致膠體金的形貌多呈現橢圓狀或不規則形狀。隨著溶液ph值增大，au3+配合物中oh-配體的數增加到2或3，其對應的物種活性也隨之降低，此時金納米顆粒的形成機理是按照成核-生長路線進行，有利于得到粒徑均勻的單分散膠體金產物。除了au3+配合物反應活性的影響外，ph值的變化對檸檬酸鈉的羧基結構同樣有影響，反應溶液ph值較低，意味著金納米顆粒表面電荷較低導致顆粒間的排斥作用減弱，膠體金容易發生聚集，隨著ph值增大到高于其第三個電離點(ph＝6.4)，檸檬酸鈉的主要存在形式是檸檬酸鹽，反應生成的金納米核表面電荷增加，粒子間的聚集情況減弱，進而有利于得到穩定性優異且顆粒濃度高的膠體金。本發明通過合理調整反應體系的ph值和反應溫度，達到既可以保證膠體金粒徑單分散又可以顯著提高膠體金穩定性和顆粒濃度。
16、與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：
17、本發明的單分散性免疫檢測用膠體金的制備方法具有操作簡單、重復性好、成本低廉，適合于大規模生產等特點，所制備的膠體金具有穩定性好、球形單分散且金納米顆粒濃度高等優點，使其更適合生物標記和免疫層析技術的需求。
1.一種單分散免疫檢測用膠體金的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種單分散免疫檢測用膠體金的制備方法，其特征在于，步驟(s1)中，所述氯金酸與去離子水的用量比為0.05～0.25mmol：100ml。
3.根據權利要求1所述的一種單分散免疫檢測用膠體金的制備方法，其特征在于，步驟(s1)中，所述后處理為利用ph調節劑調節ph值至2.5～5。
4.根據權利要求3所述的一種單分散免疫檢測用膠體金的制備方法，其特征在于，所述ph調節劑選自鹽酸、氫氧化鈉或三(羥甲基)氨基甲烷中的一種。
5.根據權利要求1所述的一種單分散免疫檢測用膠體金的制備方法，其特征在于，步驟(s2)中，檸檬酸鈉與氯金酸的摩爾比為2～10：1。
6.根據權利要求1所述的一種單分散免疫檢測用膠體金的制備方法，其特征在于，步驟(s2)中，反應過程中，溫度為75～95℃，反應至溶液顏色不變。
7.根據權利要求1所述的一種單分散免疫檢測用膠體金的制備方法，其特征在于，步驟(s2)中，所述后處理為攪拌冷卻至室溫后低溫避光保存。
8.根據權利要求7所述的一種單分散免疫檢測用膠體金的制備方法，其特征在于，單分散免疫檢測用膠體金處于2～8℃下避光保存。
9.一種通過權利要求1～8任一所述方法制備得到的單分散免疫檢測用膠體金。
10.一種如權利要求9所述的單分散免疫檢測用膠體金在免疫檢測中的應用。