本發(fā)明屬于分子生物，具體涉及一種 gtf1基因編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的突變體及其在制備nmn中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、β-煙酰胺單核苷酸(nmn)是哺乳動(dòng)物體內(nèi)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)合成的關(guān)鍵前體物質(zhì)之一，其具備抑制神經(jīng)和血管老化、改善慢性疾病的作用，在保健食品和醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。
2、nmn的生物合成途徑主要包括兩種：生物酶法和全細(xì)胞催化法。生物酶法利用純化酶進(jìn)行催化，具備快速、高濃度、反應(yīng)體系簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)，技術(shù)關(guān)鍵在于酶的穩(wěn)定性和活性；全細(xì)胞催化法則是篩選或改造特定菌株的代謝途徑，在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模下，利用微生物的整個(gè)細(xì)胞作為催化劑，生產(chǎn)流程簡(jiǎn)單且生產(chǎn)成本較低，但存在微生物代謝途徑設(shè)計(jì)改造的技術(shù)壁壘，工業(yè)化生產(chǎn)難度較大。shoji等人通過(guò)過(guò)表達(dá)特定基因、引入prpp合成酶和nampt以及異源轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，增強(qiáng)了磷酸戊糖途徑和nmn的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)效率；竺偉等人使用r-5-p、nam作為底物，通過(guò)固定化工程菌全細(xì)胞，表達(dá)了nampt和prpps酶，進(jìn)行催化合成。
3、目前雖然已有多種用于提高nmn產(chǎn)量的方法，但多集中于質(zhì)粒系統(tǒng)及其所攜帶基因的改造，涉及大腸桿菌基因組的調(diào)整較少，提高大腸桿菌底盤(pán)細(xì)胞與外源基因的適配性仍有進(jìn)一步研究的必要性。
4、 gtf1基因，即谷氨酰-trna（gln）酰胺基轉(zhuǎn)移酶亞基f，存在于大腸桿菌中，其編碼糖基轉(zhuǎn)移酶。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種 gtf1基因編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的突變體及其在制備nmn中的應(yīng)用。
2、本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)將大腸桿菌 e.?coli2d中的 gtf1基因編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的第150位賴(lài)氨酸突變?yōu)楣劝彼幔軌蚪档透碑a(chǎn)物的生成，提高nmn的產(chǎn)量。通過(guò)對(duì)大腸桿菌 e.?coli2d中的糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因 gtf1進(jìn)行改造以實(shí)現(xiàn)糖基轉(zhuǎn)移酶的突變，可有效提高gtf1基因的表達(dá)，從而降低副產(chǎn)物的生成，提高nmn的產(chǎn)量。
3、本發(fā)明技術(shù)方案如下：
4、一種 gtf1基因編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的突變體，氨基酸突變位點(diǎn)為 gtf1基因編碼糖基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列seq?id?no.3的第150位賴(lài)氨酸突變?yōu)楣劝彼幔蛔凅w的氨基酸序列如seqid?no.4所示。
5、上述突變體的編碼基因，根據(jù)氨基酸的突變位點(diǎn)，在 gtf1基因的核苷酸序列seqid?no.1上，進(jìn)行定點(diǎn)突變獲得。
6、根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，上述突變體的編碼基因核苷酸序列如seq?id?no.2所示。
7、一種重組菌，包含上述突變體的編碼基因。
8、根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述重組菌中還包含重組質(zhì)粒petduet-1-nampt-prs-rk和重組質(zhì)粒pcdfduet-1-niap-pnuc-rabc；
9、所述重組質(zhì)粒petduet-1-nampt-prs-rk，核苷酸序列如seq?id?no.14所示；
10、所述重組質(zhì)粒pcdfduet-1-niap-pnuc-rabc，核苷酸序列如seq?id?no.15所示。
11、根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述重組菌的宿主菌為大腸桿菌。
12、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述大腸桿菌為大腸桿菌e.?coli?bl21?(de3)。
13、一種大腸桿菌重組菌，為將含有重組質(zhì)粒petduet-1-nampt-prs-rk和重組質(zhì)粒pcdfduet-1-niap-pnuc-rabc的大腸桿菌e.?coli?bl21?(de3)重組菌中的糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因 gtf1進(jìn)行定點(diǎn)突變，突變后的 gtf1基因編碼蛋白的第150位賴(lài)氨酸突變?yōu)楣劝彼幔?
14、所述 gtf1基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示；
15、所述重組質(zhì)粒petduet-1-nampt-prs-rk，核苷酸序列如seq?id?no.14所示；
16、所述重組質(zhì)粒pcdfduet-1-niap-pnuc-rabc，核苷酸序列如seq?id?no.15所示。
17、根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，突變后的 gtf1基因核苷酸序列如seq?id?no.2所示。
18、上述大腸桿菌重組菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟：
19、（1）將重組質(zhì)粒petduet-1-nampt-prs-rk和重組質(zhì)粒pcdfduet-1-niap-pnuc-rabc轉(zhuǎn)入大腸桿菌e.?coli?bl21?(de3)，得到重組菌，命名為大腸桿菌 e.?coli2d；
20、（2）利用crispr/cas9系統(tǒng)對(duì)大腸桿菌 e.?coli2d中的基因 gtf1進(jìn)行定點(diǎn)突變，突變后的 gtf1基因編碼蛋白的第150位賴(lài)氨酸突變?yōu)楣劝彼幔玫酱竽c桿菌突變菌株 e.? coli2d-gtf1m。
21、根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，步驟（2），利用crispr/cas9系統(tǒng)對(duì)大腸桿菌 e.?coli2d進(jìn)行定點(diǎn)突變，具體包括如下：
22、①設(shè)計(jì)基因突變用同源臂引物：根據(jù) gtf1分別設(shè)計(jì)上游同源臂引物f1和r1、下游同源臂引物f2和r2；
23、②制備donor?dna：分別使用步驟①中的f1和r1擴(kuò)增 gtf1的上游同源臂，使用f2和r2擴(kuò)增 gtf1的下游同源臂；然后利用重疊pcr方法將上游同源臂和下游同源臂連接，得線(xiàn)性基因片段donor?dna-gtf1m；
24、③ptargetf-gtf1質(zhì)粒的構(gòu)建：以ptargetf質(zhì)粒作為模板，使用引物f3和r3反向pcr擴(kuò)增ptargetf質(zhì)粒，將擴(kuò)增產(chǎn)物利用試劑盒進(jìn)行回收純化，得到攜帶有靶向目的基因n20序列seq?id?no.20的ptargetf-gtf1線(xiàn)性基因片段；將ptargetf-gtf1線(xiàn)性基因片段轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中完成環(huán)化，并提取得ptargetf-gtf1質(zhì)粒；
25、所述n20序列：ccttaatgtcaagagcgataseq?id?no.20；
26、④pcas質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：將pcas?質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 e.?coli2d感受態(tài)細(xì)胞，篩選獲得攜帶有pcas質(zhì)粒的大腸桿菌 e.?coli2d，并制備成感受態(tài)細(xì)胞；
27、⑤將步驟②制備的donor?dna-gtf1m和步驟③制備的ptargetf-gtf1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化步驟④制備的攜帶有pcas質(zhì)粒的大腸桿菌 e.?coli2d感受態(tài)細(xì)胞，在含有kan和spe的雙抗性lb固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落；
28、⑥篩選陽(yáng)性克隆菌株和助手質(zhì)粒消除：以步驟⑤中的單菌落為模板，使用引物f4和r2進(jìn)行菌落pcr，獲得未有擴(kuò)增產(chǎn)物的陽(yáng)性克隆菌株；分別消除陽(yáng)性克隆菌株中的ptargetf-gtf1質(zhì)粒和pcas質(zhì)粒，得大腸桿菌突變菌株 e.?coli2d-gtf1m。
29、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟①中的f1序列如seq?id?no.5所示，r1序列如seq?idno.6所示；f2序列如seq?id?no.7所示，r2序列如seq?id?no.8所示。
30、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟③中的f3序列如seq?id?no.9所示，r3序列如seq?idno.10所示。
31、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟⑥中的f4序列如seq?id?no.11所示。
32、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟⑥中消除ptargetf-gtf1質(zhì)粒和pcas質(zhì)粒的方法為：
33、ⅰ?將獲得的陽(yáng)性克隆菌株接種至含有kan和iptg的lb液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫震蕩培養(yǎng)一天，得菌液；
34、ⅱ?將步驟ⅰ中的菌液在lb固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線(xiàn)純化，并置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落，挑取單菌落于lb液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫震蕩培養(yǎng)，消除ptargetf-gtf1質(zhì)粒和pcas質(zhì)粒。
35、上述突變體的編碼基因、上述重組菌或上述大腸桿菌重組菌在制備nmn中的應(yīng)用。
36、本發(fā)明的有益效果至少包括如下：
37、本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)將大腸桿菌 e.?coli2d中的 gtf1基因編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的第150位賴(lài)氨酸突變?yōu)楣劝彼幔軌蚪档透碑a(chǎn)物的生成，提高nmn的產(chǎn)量，利用crispr技術(shù)對(duì)大腸桿菌 e.?coli2d中的糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因進(jìn)行改造以實(shí)現(xiàn)糖基轉(zhuǎn)移酶的突變，構(gòu)建得到大腸桿菌突變菌株 e.?coli2d-gtf1m；與原始菌株相比， e.?coli2d-gtf1m能夠提高產(chǎn)nmn效率，降低副產(chǎn)物煙酸（na）的生成，降低生產(chǎn)成本。