本發明屬于酶催化，具體涉及一種非特異性5’-核苷酸酶在制備煙酰胺核糖中的應用。
背景技術：
1、煙酰胺單核苷酸（β-nicotinamide?mononucleotide，nmn）和煙酰胺核糖（nicotinamide?riboside，nr）均是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nad+）的關鍵前體物質，在抗衰老、能量代謝和dna修復中具有核心作用。然而，煙酰胺單核苷酸（nmn）與煙酰胺核糖（nr）的生物利用度及代謝途徑存在顯著差異：①盡管煙酰胺單核苷酸（nmn）可通過直接補充提升煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nad+）水平，但其分子量較大且含有磷酸基團，難以穿透細胞膜，需依賴特定轉運蛋白（如slc12a8）進入細胞，導致口服利用率較低。此外，煙酰胺單核苷酸（nmn）在消化系統中易被降解為煙酰胺（nam），進一步降低其有效性；②煙酰胺核糖（nr）作為更小的非磷酸化分子，可高效通過細胞膜，并在胞內經磷酸化生成煙酰胺單核苷酸（nmn），最終合成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nad+）。
2、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nad+）是氧化還原酶和其他煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nad+）消耗酶的必不可少的輔酶，它不僅在維持人類細胞的功能中起著重要作用，而且對于許多工業生物催化過程而言，它也是重要的輔助因子。對于大多數生物體，直接補充煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nad+）的外源性補充受到兩個因素的限制：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nad+）的高成本和非常低的同化效率。因此，補充煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nad+）前體已成為提高煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nad+）水平的有效方法。
3、煙酰胺核糖（nr）在提高煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nad+）濃度方面具有比常規維生素b3（煙酰胺（nam）、煙酸）更優勢。煙酰胺核糖（nr）的各種生物學作用也得到了證實，例如增強氧化代謝、促進難治性傷口的愈合、改善了肌肉質量和性能、改善炎癥和氧化代謝、改善基因沉默、延長壽命。在幾項人類干預研究中發現，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nad+）前體的膳食補充劑可改善煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nad+）水平，其中煙酰胺核糖（nr）具有最佳效果。此外，與其他前體相比，煙酰胺核糖（nr）沒有副作用，更適合應用于食品、醫療保健和其他領域。
4、目前商業化的煙酰胺核糖（nr）主要有兩種化學方法合成：1、煙酰胺（nam）及其衍生物與過酰化的（鹵）-d-核糖-呋喃糖通過糖基化反應形成中間體，進而合成煙酰胺核糖（nr）鹽；2、利用n?-?(?2?,?4?-二硝基苯)?-?3?-氨甲酰基吡啶鎓鹽與d?-呋喃核糖胺的衍生物通過縮合反應形成煙酰胺核糖（nr）。
5、化學合成煙酰胺核糖（nr）(主要包括溴化鹽和氯化鹽)的主要缺點是煙酰胺核糖（nr）鹽的糖苷鍵與其他核苷酸相比不穩定。而且溴化物鹽有毒性，很大地限制其應用；氯化物鹽在水溶液中容易水解。化學合成方法也相對復雜和昂貴，因此，有必要開發一種能夠有效合成煙酰胺核糖（nr）的方法。
6、在2022年已報道實現了從煙酰胺（nam）高效合成煙酰胺單核苷酸（nmn）。在2023年報道了利用大腸桿菌來源的usha蛋白水解煙酰胺單核苷酸（nmn），構建出高效生成煙酰胺核糖（nr）的菌株。目前報道的植物源的5′-核苷酸酶（如羽衣甘藍中的boln2、boln5-x1和boln6）及大腸桿菌來源的usha蛋白可催化煙酰胺單核苷酸（nmn）水解生成煙酰胺核糖（nr），但其水解速度有限，限制了煙酰胺核糖（nr）的生成。因此有必要尋找一種5′-核苷酸酶能高效催化高濃度的煙酰胺單核苷酸（nmn）水解生成煙酰胺核糖（nr）。
技術實現思路
1、本發明的目的在于尋找一種能高效催化高濃度的煙酰胺單核苷酸（nmn）水解生成煙酰胺核糖（nr）的5′-核苷酸酶，用于解決現有技術中的問題。具體的，結合生物信息學分析和昱菘生物的5′-核苷酸酶酶庫，進行酶資源的挖掘和篩選，篩選得到5′-核苷酸酶。經大腸桿菌表達系統表達后以煙酰胺單核苷酸（nmn）為底物進行催化反應，比較野生型和突變體的轉化率和選擇性，具體的反應路線如下所示：
2、
3、本發明通過以下技術方案解決上述技術問題。
4、本發明的第一方面提供一種非特異性5’-核苷酸酶在制備煙酰胺核糖中的應用；
5、其中，所述非特異性5’-核苷酸酶選自來源于希瓦氏菌屬hn-41（shewanella?sp.hn-41）的非特異性5’-核苷酸酶。
6、在一些實施方案中，所述非特異性5’-核苷酸酶具有如seq?id?no:?5所示的氨基酸序列。
7、在一些具體實施方案中，所述非特異性5’-核苷酸酶的氨基酸序列如seq?id?no:5所示。
8、在一些實施方案中，所述非特異性5’-核苷酸酶由具有如seq?id?no:?13所示的核苷酸序列編碼。
9、在一些具體實施方案中，編碼所述非特異性5’-核苷酸酶的核苷酸序列如seq?idno:?13所示。
10、在一些實施方案中，所述煙酰胺核糖通過所述非特異性5’-核苷酸酶催化煙酰胺單核苷酸反應獲得。
11、本發明的第二方面提供一種制備煙酰胺核糖的方法，所述方法包括通過所述非特異性5’-核苷酸酶催化煙酰胺單核苷酸反應獲得煙酰胺核糖；
12、所述非特異性5’-核苷酸酶選自來源于希瓦氏菌屬hn-41（shewanella?sp.?hn-41）的非特異性5’-核苷酸酶。
13、在一些實施方案中，所述非特異性5’-核苷酸酶具有如seq?id?no:?5所示的氨基酸序列。
14、在一些具體實施方案中，所述非特異性5’-核苷酸酶的氨基酸序列如seq?id?no:5所示。
15、在一些實施方案中，所述非特異性5’-核苷酸酶由具有如seq?id?no:?13所示的核苷酸序列編碼。
16、在一些具體實施方案中，編碼所述非特異性5’-核苷酸酶的核苷酸序列如seq?idno:?13所示。
17、在一些實施方案中，所述非特異性5’-核苷酸酶的使用形式選自純酶、粗酶液、發酵液、酶粉和固定化酶。
18、在一些實施方案中，所述反應的反應體系中：所述煙酰胺單核苷酸的濃度為至少5g/l。
19、在一些優選實施方案中，所述煙酰胺單核苷酸的濃度為5g/l-40g/l。
20、在一些實施方案中，所述反應體系還包含二價金屬離子。
21、在一些優選實施方案中，所述二價金屬離子為鎂離子。
22、在一些實施方案中，所述反應的反應溫度為28-30℃。
23、在一些實施方案中，所述粗酶液通過如下方法制備：對表達所述非特異性5’-核苷酸酶的細胞在緩沖液中進行超聲破碎，高速離心后取上清即得。
24、在一些實施方案中，表達所述非特異性5’-核苷酸酶的細胞為大腸桿菌細胞，所述大腸桿菌細胞例如為大腸桿菌bl21(de3)。
25、在一些優選實施方案中，所述粗酶液在反應中的用量為2-20%（v/v）。
26、在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。
27、本發明所用試劑和原料均市售可得。
28、本發明的積極進步效果在于：
29、本發明的非特異性5’-核苷酸酶能高效催化高濃度的煙酰胺單核苷酸（nmn）水解生成煙酰胺核糖（nr），具有較高的酶活以及工業化應用的價值。