本發(fā)明屬于生物工程，具體地說，是關(guān)于一種快速利用木糖的需鈉弧菌工程菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、近年來，由于認(rèn)識到化石燃料的片面依賴性和暫時性，科學(xué)界已將研究范式轉(zhuǎn)向生物途徑，以找到一種生產(chǎn)可持續(xù)能源的方法，滿足全球快速增長的人口和需求。
2、過去幾十年來，人們對通過有效利用可再生原料發(fā)酵生產(chǎn)燃料、聚合物和化學(xué)品等高附加值產(chǎn)品的興趣與日俱增。依賴糧食作物、油料種子和動物脂肪等第一代生物質(zhì)進(jìn)行能源或生化生產(chǎn)，不僅增加了經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，還引發(fā)了糧食與飼料的資源競爭。第二代生物質(zhì)通常包括來自糖和飲料行業(yè)等各個行業(yè)的廢物流，農(nóng)業(yè)廢物主要包括木纖維素廢物，如來自能源作物的草、木質(zhì)原生木材和森林殘留物，是生物燃料或生化生產(chǎn)的有吸引力的原料，因為它不會干擾食物鏈供應(yīng)。
3、目前，全球每年生產(chǎn)200×109噸的木纖維素生物質(zhì)(lcb)，其中只有3％用于非食品用途，lcb的主要吸引力在于其對環(huán)境的碳排放影響最小，lcb水解后，纖維素和半纖維素的解聚分別產(chǎn)生葡萄糖和木糖。其中五碳糖木糖是地球上第二豐富的糖，將木糖原料轉(zhuǎn)化為生物燃料在經(jīng)濟上非常重要，因為從植物材料中水解的半纖維素可產(chǎn)生高達(dá)90％的木糖。與葡萄糖一樣，木糖的利用取決于是否存在一些基本和重要的木糖還原途徑，如xr-xdh途徑，該途徑涉及木糖還原酶和木糖醇脫氫酶，它們將木糖轉(zhuǎn)化為d-木糖，而這種途徑在大多數(shù)微生物中并不存在。
4、雖然對利用木糖作為生產(chǎn)產(chǎn)品的主要碳源的微生物研究仍處于早期階段，但通過合理的代謝工程找到工業(yè)上可行的菌株并進(jìn)行改造，通過這種工程，微生物可以利用木糖生產(chǎn)生物基產(chǎn)品，可以以高滴度實現(xiàn)，這對可持續(xù)生物經(jīng)濟的成功至關(guān)重要。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本申請的發(fā)明人通過對需鈉弧菌野生型菌株atcc?14048進(jìn)行改造以及適應(yīng)性進(jìn)化等措施，獲得了一株能夠快速利用木糖且生長穩(wěn)定的基因工程菌。進(jìn)一步對于代謝途徑進(jìn)行改造，成功獲得了能夠利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸、游離脂肪酸等生物基產(chǎn)品的基因工程菌。
2、因此，本發(fā)明的第一個方面，提供了一種快速利用木糖的需鈉弧菌(vibrionatriegens)基因工程菌vnx，該菌株的保藏編號為cctcc?m?2025940。
3、本發(fā)明的第二個方面，提供了所述基因工程菌vnx用于生產(chǎn)生物基產(chǎn)品的應(yīng)用。
4、本發(fā)明的第三個方面，提供了一種需鈉弧菌(vibrio?natriegens)基因工程菌，該工程菌是在上述的需鈉弧菌(vibrio?natriegens)基因工程菌vnx的基礎(chǔ)上過表達(dá)乙酰-coa羧化酶基因acc和丙二酰-coa還原酶基因mcr而得到。
5、根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，所述過表達(dá)乙酰-coa羧化酶基因acc是轉(zhuǎn)入了來源于corynebacterium?glutamicum的dtsr1和accbc基因，所述dtsr1和accbc基因的核苷酸序列分別如seq?id?no.5和seq?id?no.6所示。
6、進(jìn)一步的，所述過表達(dá)丙二酰-coa還原酶基因mcr是轉(zhuǎn)入了來源于chloroflexusaurantiacus且經(jīng)過突變和密碼子優(yōu)化的mcr*基因而得到，所述經(jīng)過突變和密碼子優(yōu)化的mcr*基因的核苷酸序列如seq?id?no.7所示。
7、本發(fā)明的第四個方面，提供了所述的需鈉弧菌(vibrio?natriegens)基因工程菌用于以木糖為底物發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸。
8、本發(fā)明的第五個方面，提供了一種需鈉弧菌(vibrio?natriegens)基因工程菌，該工程菌是在上述的需鈉弧菌(vibrio?natriegens)基因工程菌vnx的基礎(chǔ)上過表達(dá)硫酯酶編碼基因而得到。
9、根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，所述過表達(dá)硫酯酶編碼基因是轉(zhuǎn)入了不同來源的硫酯酶編碼基因或融合基因，所述不同來源的硫酯酶編碼基因或融合基因選自：
10、(1)來源于c.hookeriana的硫酯酶編碼基因fatb2，其核苷酸序列如seq?id?no.10所示；
11、(2)將來源于c.hookeriana的fatb2與來源于r.communis的fatb1*融合表達(dá)得到的硫酯酶編碼基因fatb21*，其核苷酸序列如seq?id?no.11所示；和
12、(3)將來源于r.communis的fatb1*的前導(dǎo)鏈與來源于c.palustris的fatb1的非前導(dǎo)鏈部分融合表達(dá)得到的硫酯酶編碼基因fatb11*，其核苷酸序列如seq?id?no.12所示。
13、本發(fā)明的第六個方面，提供了所述的需鈉弧菌(vibrio?natriegens)基因工程菌用于以木糖為底物發(fā)酵生產(chǎn)游離脂肪酸的應(yīng)用。
14、本發(fā)明具有以下有益效果：
15、1、本發(fā)明在需鈉弧菌野生型菌株基礎(chǔ)上，構(gòu)建了內(nèi)源過表達(dá)xyla的木糖利用途徑，以及整合來自大腸桿菌的xyla從而打通木糖利用途徑，利用基因工程手段對底盤菌株進(jìn)行的改造，獲得的工程菌株vnx在以木糖為碳源的培養(yǎng)基中能夠快速穩(wěn)定地生長。
16、2、將構(gòu)建的外源表達(dá)3-羥基丙酸途徑轉(zhuǎn)化至vnx中，獲得的菌株vnx(m*da)能夠在以木糖為碳源的培養(yǎng)基中生產(chǎn)3-羥基丙酸；將構(gòu)建的異源合成游離脂肪酸途徑轉(zhuǎn)化至vnx中，獲得的三株工程菌vnx(ptrc99a-trc-fatb2)、vnx(ptrc99a-trc-fatb11*)和vnx(ptrc99a-trc-fatb21*)均能利用木糖生產(chǎn)脂肪酸，可知本發(fā)明的工程菌株vnx能夠根據(jù)需要通過代謝途徑的改造、并以木糖為碳源用于生產(chǎn)生物基產(chǎn)品。
1.一種快速利用木糖的需鈉弧菌(vibrio?natriegens)基因工程菌vnx，其特征在于，所述菌株的保藏編號為cctcc?m?2025940。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的需鈉弧菌(vibrio?natriegens)基因工程菌vnx的應(yīng)用，其特征在于，用于以木糖為底物發(fā)酵生產(chǎn)生物基產(chǎn)品。
3.一種需鈉弧菌(vibrio?natriegens)基因工程菌，其特征在于，所述工程菌是在權(quán)利要求1所述的需鈉弧菌(vibrio?natriegens)基因工程菌vnx的基礎(chǔ)上過表達(dá)乙酰-coa羧化酶基因acc和丙二酰-coa還原酶基因mcr而得到。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的需鈉弧菌(vibrio?natriegens)基因工程菌，其特征在于，所述過表達(dá)乙酰-coa羧化酶基因acc是轉(zhuǎn)入了來源于corynebacterium?glutamicum的dtsr1和accbc基因，所述dtsr1和accbc基因的核苷酸序列分別如seq?id?no.5和seq?id?no.6所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的需鈉弧菌(vibrio?natriegens)基因工程菌，其特征在于，所述過表達(dá)丙二酰-coa還原酶基因mcr是轉(zhuǎn)入了來源于chloroflexus?aurantiacus且經(jīng)過突變和密碼子優(yōu)化的mcr*基因而得到，所述經(jīng)過突變和密碼子優(yōu)化的mcr*基因的核苷酸序列如seq?id?no.7所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求3～5中任一項所述的需鈉弧菌(vibrio?natriegens)基因工程菌的應(yīng)用，其特征在于，用于以木糖為底物發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸。
7.一種需鈉弧菌(vibrio?natriegens)基因工程菌，其特征在于，所述工程菌是在權(quán)利要求1所述的需鈉弧菌(vibrio?natriegens)基因工程菌vnx的基礎(chǔ)上過表達(dá)硫酯酶編碼基因而得到。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的需鈉弧菌(vibrio?natriegens)基因工程菌，其特征在于，所述過表達(dá)硫酯酶編碼基因是轉(zhuǎn)入了不同來源的硫酯酶編碼基因或融合基因，所述不同來源的硫酯酶編碼基因或融合基因選自：
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的需鈉弧菌(vibrio?natriegens)基因工程菌的應(yīng)用，其特征在于，用于以木糖為底物發(fā)酵生產(chǎn)游離脂肪酸。