本發明涉及一種提高重組膠原蛋白可溶性表達及穩定性的方法，屬于基因工程。
背景技術：
1、膠原蛋白是哺乳動物中含量最多的蛋白質，廣泛分布于皮膚、骨骼、肌腱、血管系統、肌肉結締組織等，至今已發現28種類型，主要分為纖維性膠原蛋白、網狀膠原蛋白、珠狀絲狀膠原蛋白、錨定纖維蛋白等，其中纖維性膠原蛋白中ⅰ型、ⅱ型、ⅲ型膠原蛋白占人體膠原蛋白的80％～90％。
2、膠原蛋白序列是由重復肽三聯體(gly-xaa-yaa)組成，其中xaa和yaa通常是脯氨酸和羥脯氨酸。膠原蛋白的結構基礎是由3條α鏈交錯形成聚脯氨酸ⅱ型的左手螺旋構象，即三螺旋結構，正確折疊的三螺旋結構對于膠原蛋白在細胞外基質實現細胞與細胞之間相互作用至關重要。對膠原蛋白序列的研究表明膠原蛋白三條鏈的緊密包裝、鏈之間形成的氫鍵、廣泛的水合網絡以及高含量的脯氨酸和羥脯氨酸是影響膠原蛋白三螺旋結構穩定的重要因素。由于膠原蛋白具有良好的生物學特性，其在組織工程、臨床醫學、食品工業、包裝材料、化妝品、醫學美容、生物材料以及醫療器械等方面都有著廣泛的應用。
3、目前，根據來源，膠原蛋白主要分為動物提取膠原蛋白和重組膠原蛋白。動物源膠原蛋白主要來源于陸生動物以及海洋動物，提取過程復雜且存在安全隱患。而重組膠原蛋白是將膠原蛋白基因克隆到選定的表達載體并轉化到表達細胞內，最后通過純化技術所獲得的蛋白質。重組膠原蛋白純度更高、可大批量生產、批次間差異小、有良好的水溶性、可加工性強、無病毒隱患、具有更低的排異反應，更重要的是可通過對重組膠原中的基因序列進行修改使其具備更多生物功能，從而在組織工程及再生醫學等領域具有廣泛的應用前景。
4、目前重組膠原蛋白常用的表達系統有大腸桿菌(escherichia?coli)，大腸桿菌作為研究最為詳盡的原核細菌，具有遺傳背景清晰、便于遺傳操作以及發酵周期短、表達量高等優點，是蛋白質異源表達最廣泛的宿主菌。但是由于缺乏翻譯后修飾，重組膠原蛋白往往難以正確折疊形成三螺旋結構。
5、發明人團隊前期研究中通過膠原蛋白的序列設計使得重組膠原蛋白可以正確折疊形成三螺旋結構，齊靜靜碩士論文《仿生微纖維膠原蛋白的設計及異源表達》，通過蛋白質計算分析和熱穩定性預測對ι型膠原蛋白的α1鏈進行分析，選取預測tm值接近37℃、三股螺旋傾向性高的序列，并在序列的n和c端加入(gpp)10序列，形成具有不同暗條紋長度的周期性明暗相間條紋的帶狀纖維。但是該序列產量低，熱穩定性仍有待提高；胡金遠論文《富脯氨酸膠原蛋白的重組表達及熱穩性研究》，在膠原序列兩端添加(gpp)n(n＝5,10,15),發現膠原區域兩端嵌合一定長度的(gpp)n短肽可以促進膠原區域的折疊，但是過長的(gpp)15會導致膠原區域無法正確折疊形成三股螺旋結構；cn111333715b公開了一種類i型膠原蛋白纖維的制備方法，以n和c端(gpp)10序列為基礎，在中間插入連續的gly-xaa-yaa三聯體的膠原蛋白序列，形成具有周期性明暗相間條紋的帶狀纖維。但是現有技術均存在蛋白存在表達量低、穩定性差等問題。
6、因此，有必要設計出可以提高重組膠原蛋白表達量，且穩定性高、能夠促進重組膠原蛋白正確折疊形成三螺旋結構的方法。
技術實現思路
1、為解決現有技術膠原蛋白表達量低、穩定性差的問題，本發明在重復序列(gpp)10的基礎上，將序列中的部分脯氨酸改造為天冬氨酸和賴氨酸。本發明的方法和重復序列改進方式，具有通用性，適用于多種膠原蛋白域，改進后的重復序列構建得到的膠原蛋白較(gpp)10構建得到的膠原蛋白，具有表達量提高、熱穩定性保持或提高、溶解度提高的優點，而且同時還能保持較好的耐鹽性。
2、本發明的第一個目的是提供一種膠原蛋白單鏈，所述單鏈包括如第一重復序列-膠原域-第二重復序列的結構(如圖10所示)；其中，第一重復序列和第二重復序列中至少一個的氨基酸序列含有如seq?id?no.4(簡稱kd2)或seq?id?no.5(簡稱kd3)所示的序列；且當第一重復序列為seq?id?no.4時，第二重復序列為seq?id?no.4或者seq?id?no.3。
3、在一種實施方式中，所述膠原蛋白單鏈的第一重復序列和第二重復序列中，有一條的氨基酸序列如seq?id?no.3(簡稱p10)所示。
4、在一種實施方式中，所述膠原蛋白單鏈的第一重復序列的氨基酸序列如seq?idno.5所示，第二重復序列的氨基酸序列如seq?id?no.3(簡稱p10)所示；
5、或者，膠原蛋白單鏈第一重復序列的氨基酸序列如seq?id?no.3所示，第二重復序列的氨基酸序列如seq?id?no.4所示；
6、或者，膠原蛋白單鏈第一重復序列的氨基酸序列如seq?id?no.3所示，第二重復序列的氨基酸序列如seq?id?no.5所示；
7、或者，膠原蛋白單鏈的第一重復序列和第二重復序列均如seq?id?no.4所示。
8、本發明的核心要點在于重復序列的設計，可以適用于不同的膠原域，都能產生表達量提高、穩定性提高、溶解度提高中的任意一個或者多個效果。可選地，膠原域可以是任一來自人源膠原蛋白的膠原域序列或細菌膠原蛋白的膠原域序列；比如，所述膠原域序列可以是cn111333715a中公開的膠原域序列，也可以是cn?117186210?a中公開的膠原域序列。
9、在一種實施方式中，所述膠原域的氨基酸序列如seq?id?no.16～22所示；或者由seq?id?no.16～18中任意兩條氨基酸序列組合得到；或者由seq?id?no.16～22中任一所示氨基酸序列進行2～3次重復得到。可選地，所述膠原域的氨基酸序列是seq?id?no.16和seqid?no.17按照先后順序拼接得到的，或者使用2個seq?id?no.17拼接得到的。
10、在一種實施方式中，膠原域的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。
11、在一種實施方式中，所述第一重復序列的n端還含有折疊域，結構如圖9所示。
12、在一種實施方式中，折疊域與第一重復序列間通過酶切位點連接；可選地，所述酶切位點為lvprgsp。
13、在一種實施方式中，所述折疊域的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。
14、在一種實施方式中，膠原蛋白單鏈的氨基酸序列結尾還可以添加一個甘氨酸。
15、在一種實施方式中，所述膠原蛋白單鏈的氨基酸序列如seq?id?no.6～9任一所示。
16、本發明的第二個目的是提供編碼任一上述膠原蛋白單鏈的基因。
17、本發明還提供攜帶上述基因的質粒或細胞。
18、在一種實施方式中，包括：pcoldiii系列或pet系列的質粒。
19、在一種實施方式中，質粒為pcoldiii。
20、在一種實施方式中，是大腸桿菌細胞，包括e.coli?bl21、e.coli?bl21(de3)、e.coli?jm109、e.coli?dh5α或e.coli?top10。
21、在一種實施方式中，宿主細胞為e.coli?bl21(de3)。
22、本發明的第三個目的是提供一種提高膠原蛋白穩定性的方法，在膠原域的n端連接第一重復序列，c端連接第二重復序列，構建結構為第一重復序列-膠原域-第二重復序列(如圖10所示)的膠原蛋白單鏈；其中第一重復序列或第二重復序列中至少一個的氨基酸序列如seq?id?no.4或seq?id?no.5所示。
23、本發明還提供一種提高膠原蛋白可溶性的方法，在膠原域的n端連接第一重復序列，c端連接第二重復序列，構建結構為第一重復序列-膠原域-第二重復序列(如圖10所示)的膠原蛋白單鏈；其中第一重復序列或第二重復序列中至少一個的氨基酸序列如seq?idno.4或seq?id?no.5所示。
24、本發明還提供一種提高膠原蛋白產量的方法，在膠原域的n端連接第一重復序列，c端連接第二重復序列，構建結構為第一重復序列-膠原域-第二重復序列(如圖10所示)的膠原蛋白單鏈，并通過宿主細胞表達；其中第一重復序列或第二重復序列中至少一個的氨基酸序列如seq?id?no.4或seq?id?no.5所示。
25、本發明的第四個目的是提供一種膠原蛋白，由三條結構為第一重復序列-膠原域-第二重復序列(如圖10所示)的膠原蛋白單鏈組成；其中，第一重復序列和第二重復序列中至少一個的氨基酸序列還含有如seq?id?no.4(簡稱kd2)或seq?id?no.5(簡稱kd3)所示的序列。
26、在一種實施方式中，所述膠原蛋白單鏈圍繞一個共同的中心軸盤繞，構成三螺旋結構。
27、在一種實施方式中，所述膠原蛋白是將上述膠原蛋白單鏈在宿主中進行表達后，酶切去除折疊域而得到的。
28、在一種實施方式中，所述膠原蛋白單鏈第一重復序列和第二重復序列的氨基酸序列均如seq?id?no.4所示；或者，膠原蛋白單鏈第一重復序列的氨基酸序列如seq?id?no.5所示，第二重復序列的氨基酸序列如seq?id?no.3所示；或者，膠原蛋白單鏈第一重復序列的氨基酸序列如seq?id?no.3所示，第二重復序列的氨基酸序列如seq?id?no.4所示；或者膠原蛋白單鏈第一重復序列的氨基酸序列如seq?id?no.3所示，第二重復序列的氨基酸序列如seq?id?no.5所示。
29、本發明還提供由上述膠原蛋白高聚自組裝形成的膠原蛋白纖維。
30、在一種實施方式中，所述折疊域、第一重復序列之間通過酶切位點連接。可選地，所述折疊域和第一重復序列之間通過lvprgsp連接。
31、本發明還提供上述膠原單鏈或膠原蛋白或膠原蛋白纖維在制備膠原蛋白產品中的應用。
32、本發明還提供一種膠原蛋白產品，所述產品含有任一上述膠原單鏈或膠原蛋白或膠原蛋白纖維。
33、在一種實施方式中，膠原蛋白產品還含有維生素、礦物質、透明質酸、天然多糖、精油、多酚類物質、天然植物提取物等。
34、本發明還提供上述膠原單鏈或膠原蛋白或膠原蛋白纖維在制備膠原蛋白產品中的應用。
35、在一種實施方式中，所述膠原蛋白產品是化妝品、食品或藥物。
36、在一種實施方式中，所述膠原蛋白產品可以是藥物載體、醫療用品或美容產品。
37、有益效果：
38、本發明對膠原蛋白表達中的重復序列進行改進，將序列中的部分脯氨酸改造為天冬氨酸和賴氨酸。
39、本發明的方法具有通用性，適用于多種膠原蛋白域。本發明利用該改造的重復序列和不同的膠原域構建了多個膠原蛋白單鏈并實現了膠原蛋白單鏈的表達，結果發現表達量均得以提高；純化酶切后得到的純膠原蛋白均具有穩定性保持或提高、溶解度提高、保持較好的耐鹽性等特點。
40、本發明利用該改造重復序列的方法，得到了多個膠原蛋白，構建得到的膠原蛋白純度達到90％以上，較未改造、由(gpp)10組成的膠原蛋白(v-p10bp10)相比，產量提高23.6％以上、耐熱溫度提高2℃、溶解性提高，同時還保持較好的耐鹽性。