本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種乙酰化鳥苷三磷酸的合成方法。
背景技術(shù)：
1、acyntps作為pcr鏈終止劑，呋喃糖部分被2-羥基乙氧基甲基取代。這使得acyntps得到更廣泛的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，acyntps底物的錯誤率發(fā)生遠(yuǎn)低于相應(yīng)dntp或ddntp底物的水平。因此在通常使用雙脫氧核苷酸的應(yīng)用中非常有用，如dna測序和snp檢測。acyntps作為pcr鏈終止劑應(yīng)用于飛行時間質(zhì)譜平臺中。
2、而合成克級的乙酰鳥苷三磷酸是一個很大的挑戰(zhàn)，因?yàn)橐粋€乙酰鳥苷三磷酸有多個化學(xué)基團(tuán)，比如伯羥基，仲羥基和氨基等，他們的在合成中活性不同，選擇性不同，會造成大量的副產(chǎn)物，對純化來說也是一個很大的問題。
3、因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員致力于開發(fā)反應(yīng)轉(zhuǎn)化率高，副產(chǎn)物含量低，工藝穩(wěn)定的乙酰鳥苷三磷酸(acygtp)的制備工藝。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的在于提供一種乙酰化鳥苷三磷酸的合成方法。
2、在本發(fā)明的第一方面，提供了一種乙酰鳥苷三磷酸(acygtp)的制備方法，所述方法包括步驟：
3、(s1)在含水溶劑中，化合物i(n-乙酰鳥苷(acyg))和三氯氧磷反應(yīng)生成化合物ii，反應(yīng)式如下：
4、
5、在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟：
6、(s2)化合物ii和焦磷酸三正丁基銨反應(yīng)生成化合物iii，反應(yīng)式如下：
7、
8、在另一優(yōu)選例中，所述步驟(s1)中所述含水溶劑為含水的惰性溶劑。
9、在另一優(yōu)選例中，所述步驟(s1)中所述含水溶劑包括：磷酸三甲酯、水和三正丁胺。
10、在另一優(yōu)選例中，所述含水溶劑由磷酸三甲酯、水和三正丁胺組成。
11、在另一優(yōu)選例中，所述含水溶劑包括：
12、磷酸三甲酯?500-1000體積份；
13、水?????????1-5體積份；
14、三正丁胺???100-200體積份。
15、在另一優(yōu)選例中，所述含水溶劑包括：
16、磷酸三甲酯?800體積份；
17、水?????????3體積份；
18、三正丁胺???125體積份。
19、在另一優(yōu)選例中，所述步驟(s1)在氮?dú)饣蚨栊詺怏w保護(hù)下進(jìn)行反應(yīng)。
20、在另一優(yōu)選例中，所述步驟(s1)的反應(yīng)溫度為-10℃至5℃；優(yōu)選為-10℃至0℃；更優(yōu)選為約-5℃至0℃。
21、在另一優(yōu)選例中，所述步驟(s1)反應(yīng)時間為0.5-3h；優(yōu)選為約1-2h。
22、在另一優(yōu)選例中，所述步驟(s1)中先用磷酸三甲酯溶解化合物i，然后再加入水和三正丁胺；優(yōu)選地，所述化合物i與磷酸三甲酯的質(zhì)量體積比為3-10％；優(yōu)選為約6％。
23、在另一優(yōu)選例中，所述步驟(s1)中化合物i和三氯氧磷的質(zhì)量體積比(克：毫升)為50：50-100；優(yōu)選為約50：75。
24、在另一優(yōu)選例中，所述步驟(s2)在惰性溶劑中進(jìn)行反應(yīng)；優(yōu)選地所述惰性溶劑包括無水乙腈和三正丁胺；優(yōu)選地，無水乙腈和三正丁胺的體積比為750：500-1000(如750：600)。
25、在另一優(yōu)選例中，所述步驟(s2)反應(yīng)溫度為-20℃至20℃；優(yōu)選為約-15℃至20℃；更優(yōu)選為約-5℃至15℃。
26、在另一優(yōu)選例中，所述步驟(s2)中先用惰性溶劑溶解焦磷酸三正丁基銨；優(yōu)選地，三正丁基銨和惰性溶劑的質(zhì)量體積比為10％-30％；優(yōu)選地，溶解后于-20℃下預(yù)冷。
27、在另一優(yōu)選例中，所述步驟(s2)反應(yīng)結(jié)束后，加水淬滅反應(yīng)。
28、在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括對化合物i?ii進(jìn)行純化的步驟。
29、在另一優(yōu)選例中，所述方法包括步驟：
30、(1)稱取50g的n-乙酰鳥苷(acyg)，加入反應(yīng)器中，插入溫度計(jì)進(jìn)行溫度監(jiān)控；
31、(2)加入800ml的磷酸三甲酯溶解n-乙酰鳥苷,再加入3ml的水和125ml的三正丁胺，n2置換后，放于-5℃下預(yù)冷10min；
32、(3)緩慢加入75ml三氯氧磷，控制反應(yīng)溫度不超過0℃，反應(yīng)1.5h；
33、(4)稱取250g焦磷酸三正丁基銨于單口瓶中，加入750ml無水乙腈和600ml的三正丁胺，待焦磷酸三正丁基銨溶清后，放于-20℃下預(yù)冷1.5h，待(3)反應(yīng)結(jié)束后，將溶清的混合溶液快速加入至反應(yīng)器中，反應(yīng)10min；
34、待(4)反應(yīng)結(jié)束后，取6000ml水溶液，淬滅反應(yīng)，淬滅結(jié)束后，1000ml?dcm萃取，分液，得水溶液，再向水溶液中加入2m的teab溶液600ml，旋蒸后獲得目的化合物。
35、應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
1.一種乙酰鳥苷三磷酸(acygtp)的制備方法，其特征在于，所述方法包括步驟：
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟：
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(s1)中所述含水溶劑為含水的惰性溶劑。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(s1)中所述含水溶劑包括：磷酸三甲酯、水和三正丁胺。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述含水溶劑由磷酸三甲酯、水和三正丁胺組成。
6.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述含水溶劑包括：
7.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(s2)在惰性溶劑中進(jìn)行反應(yīng)；優(yōu)選地所述惰性溶劑包括無水乙腈和三正丁胺。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟(s2)中先用惰性溶劑溶解焦磷酸三正丁基銨；優(yōu)選地，三正丁基銨和惰性溶劑的質(zhì)量體積比為10％-30％。
9.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(s2)反應(yīng)結(jié)束后，加水淬滅反應(yīng)。
10.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法還包括對化合物iii進(jìn)行純化的步驟。