本發(fā)明涉及一種重組茂原鏈霉菌及構(gòu)建方法與應(yīng)用，屬于生物工程。
背景技術(shù)：
1、底盤(pán)細(xì)胞，又稱(chēng)基因底盤(pán)細(xì)胞，是一類(lèi)經(jīng)過(guò)基因組縮減或基因組合成的微生物細(xì)胞。底盤(pán)細(xì)胞通過(guò)基因組編輯，消除了蛋白質(zhì)表達(dá)的不利特征和重新布線代謝網(wǎng)絡(luò)，因此往往能獲得優(yōu)于野生型菌株的細(xì)胞適應(yīng)性、重組蛋白產(chǎn)量和外源性表達(dá)途徑的穩(wěn)定性。近年來(lái)，基于代謝工程技術(shù)和合成生物學(xué)方法構(gòu)建的微生物底盤(pán)細(xì)胞已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)各種天然高附加值化學(xué)品、優(yōu)質(zhì)清潔能源和生物材料。
2、鏈霉菌(streptomyces)是放線菌中最大的一個(gè)屬，因其擁有多種次生代謝途徑和高效的蛋白分泌機(jī)制，常作為生物醫(yī)藥和發(fā)酵工業(yè)酶蛋白的生產(chǎn)者，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。目前已有多種鏈霉菌菌株，如變鉛青鏈霉菌(streptomyces?lividans)、天藍(lán)色鏈霉菌a3(2)(streptomyces?coelicolor?a3(2))、阿維鏈霉菌(streptomycesavermitilis)、紫紅鏈霉菌(streptomyces?violaceoruber)等被改造為微生物細(xì)胞工廠，用于生產(chǎn)工業(yè)酶、抗生素、功能糖、保健品及藥物前體等目標(biāo)產(chǎn)物，表現(xiàn)出了強(qiáng)大的工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用能力。
3、茂原鏈霉菌(streptomyces?mobaraensis)是一種產(chǎn)孢子嗜溫放線菌，可用于生產(chǎn)多種抗生素和工業(yè)酶蛋白。茂原鏈霉菌(s.mobaraensis)具有安全性高、蛋白分泌能力強(qiáng)、發(fā)酵工藝成熟等特點(diǎn)，并被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(fda)認(rèn)證為gras(generallyrecognized?as?safe)安全菌株。由于其具有生理生化特征清晰，遺傳操作方法成熟，培養(yǎng)發(fā)酵較為方便等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(tgase)的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。目前，已有研究開(kāi)展對(duì)s.mobaraensis基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析，這為進(jìn)一步挖掘其基因組信息提供了有力支持，揭示了其作為底盤(pán)細(xì)胞具有廣泛的潛力，有望將其改造成更適用于蛋白合成、天然產(chǎn)物生產(chǎn)以及外源bgc表達(dá)的通用表達(dá)系統(tǒng)。
4、目前s.mobaraensis蛋白表達(dá)系統(tǒng)依然存在一些明顯的缺陷，如異源蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)量不高或不穩(wěn)定、較長(zhǎng)的菌種生長(zhǎng)周期、形態(tài)分化特征復(fù)雜且難以控制、遺傳轉(zhuǎn)化效率低，基因編輯工具少且效率低等，這些因素限制了其在工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)中的應(yīng)用。此外，與一些成熟的底盤(pán)細(xì)胞菌株，如大腸桿菌(escherichia?coli)、枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)、釀酒酵母(saccharomyces?cerevisiae)相比，s.mobaraensis底盤(pán)細(xì)胞的開(kāi)發(fā)仍然相對(duì)滯后。
5、因此，本專(zhuān)利以s.mobaraensis?dsm40587誘變菌株smy2019為研究對(duì)象，利用crispr/cas9的基因編輯系統(tǒng)對(duì)其基因組進(jìn)行了精簡(jiǎn)，從而構(gòu)建出一個(gè)敲除冗余基因的s.mobaraensis底盤(pán)細(xì)胞，旨在優(yōu)化tgase的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)，這具有重要的科學(xué)意義及工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種安全的、操作過(guò)程更簡(jiǎn)單的、能高效分泌表達(dá)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的重組茂原鏈霉菌。
2、本發(fā)明還提供上述重組茂原鏈霉菌的構(gòu)建方法。
3、本發(fā)明提供上述重組茂原鏈霉菌在發(fā)酵轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶中的應(yīng)用和作為底盤(pán)菌株在構(gòu)建發(fā)酵轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的基因工程菌中的應(yīng)用。
4、本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
5、本發(fā)明提供的一種重組茂原鏈霉菌，是一種底盤(pán)菌株，是以茂原鏈霉菌smy2019為出發(fā)菌株，是通過(guò)敲除五個(gè)最大基因組島(gis)、所有內(nèi)源crispr/cas系統(tǒng)和nhej修復(fù)途徑的相關(guān)基因得到的。其中，所述的茂原鏈霉菌smy2019是茂原鏈霉菌s.mobaraensisdsm40587的誘變菌株，其genbank登錄號(hào)為cp083590，是一種由實(shí)驗(yàn)室前期篩選的可以高效分泌轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的誘變菌株。所述的基因組島(gis)基因?yàn)間i-i、gi-ii、gi-iii、gi-iv和gi-v，其具體核苷酸序列于s.mobaraensis基因組中所處的位置如表3-1～3-6所述。所述的內(nèi)源crispr/cas系統(tǒng)基因?yàn)閏rispr1、crispr2，其具體核苷酸序列于s.mobaraensis基因組中所處的位置如表4所述。所述的nhej修復(fù)途徑基因?yàn)閗7i03_296010、k7i03_29605和k7i03_29600，其具體核苷酸序列于s.mobaraensis基因組中所處的位置如表5所述。
6、本發(fā)明提供了一株茂原鏈霉菌底盤(pán)細(xì)胞，所述底盤(pán)細(xì)胞是以茂原鏈霉菌smy2019為出發(fā)菌株，敲除其基因組上的基因組島gis基因、內(nèi)源crispr/cas系統(tǒng)基因、nhej修復(fù)途徑基因中的一種或多種得到的。
7、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述基因組島gis基因的ncbi編號(hào)分別為k7i03_28245、k7i03_28250、k7i03_28255、k7i03_28260、k7i03_28265、k7i03_28270、k7i03_28275、k7i03_28280、k7i03_28285、k7i03_28290、k7i03_28295、k7i03_28300、k7i03_28305、k7i03_28310、k7i03_28315、k7i03_28320、k7i03_28325、k7i03_28330、k7i03_28335、k7i03_28340、k7i03_28345、k7i03_28350、k7i03_28355、k7i03_28360、k7i03_28365、k7i03_28370、k7i03_28375、k7i03_28380、k7i03_28385、k7i03_28390、k7i03_28395、k7i03_28400、k7i03_28405、k7i03_28410、k7i03_28415、k7i03_28420、k7i03_28425、k7i03_28430、k7i03_28435、k7i03_28835、k7i03_28840、k7i03_28845、k7i03_28850、k7i03_28855、k7i03_28860、k7i03_28865、k7i03_28870、k7i03_28875、k7i03_28880、k7i03_28885、k7i03_28890、k7i03_28895、k7i03_28900、k7i03_28905、k7i03_28910、k7i03_28915、k7i03_28920、k7i03_28925、k7i03_28930、k7i03_28935、k7i03_28940、k7i03_28945、k7i03_28950、k7i03_28955、k7i03_28960、k7i03_28965、k7i03_28970、k7i03_28975、k7i03_28980、k7i03_28985、k7i03_28990、k7i03_28995、k7i03_29000、k7i03_29005、k7i03_18425、k7i03_18430、k7i03_18435、k7i03_18440、k7i03_18445、k7i03_18450、k7i03_18455、k7i03_18460、k7i03_18465、k7i03_18470、k7i03_18475、k7i03_18480、k7i03_18485、k7i03_18490、k7i03_18495、k7i03_18500、k7i03_18505、k7i03_18510、k7i03_18515、k7i03_18520、k7i03_18525、k7i03_18530、k7i03_18535、k7i03_18540、k7i03_18545、k7i03_18550、k7i03_18555、k7i03_18560、k7i03_18565、k7i03_18570、k7i03_18575、k7i03_18580、k7i03_18585、k7i03_18590、k7i03_18595、k7i03_18600、k7i03_18605、k7i03_18610、k7i03_03350、k7i03_03355、k7i03_03360、k7i03_03365、k7i03_03370、k7i03_03375、k7i03_03380、k7i03_03385、k7i03_03390、k7i03_03395、k7i03_03400、k7i03_03405、k7i03_03410、k7i03_03415、k7i03_03420、k7i03_03425、k7i03_03430、k7i03_03435、k7i03_03440、k7i03_03445、k7i03_03450、k7i03_03455、k7i03_03460、k7i03_03465、k7i03_01620、k7i03_01625、k7i03_01630、k7i03_01635、k7i03_01640、k7i03_01645、k7i03_01650、k7i03_01655、k7i03_01660、k7i03_01665、k7i03_01670、k7i03_01675、k7i03_01680、k7i03_01685、k7i03_01690、k7i03_01695、k7i03_01700、k7i03_01705、k7i03_01710、k7i03_01715、k7i03_01720、k7i03_01725、k7i03_01730；所述內(nèi)源crispr/cas系統(tǒng)基因?yàn)槊溍咕鷖my2019基因組上的第1358697位至1368646位，以及第1437389位至1442520位；所述nhej修復(fù)途徑基因的ncbi編號(hào)分別為k7i03_29600、k7i03_29605、k7i03_29610。
8、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述底盤(pán)細(xì)胞是以茂原鏈霉菌smy2019為出發(fā)菌株，敲除其基因組上的基因組島gis基因得到的。
9、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述底盤(pán)細(xì)胞是以茂原鏈霉菌smy2019為出發(fā)菌株，敲除其基因組上的基因組島gis基因，及其基因組上的第1358697位至1368646位得到的。
10、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述底盤(pán)細(xì)胞是以茂原鏈霉菌smy2019為出發(fā)菌株，敲除其基因組上的基因組島gis基因，及其基因組上的內(nèi)源crispr/cas系統(tǒng)基因得到的。
11、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述底盤(pán)細(xì)胞是以茂原鏈霉菌smy2019為出發(fā)菌株，敲除其基因組上的基因組島gis基因、其基因組上的內(nèi)源crispr/cas系統(tǒng)基因及其nhej修復(fù)途徑基因得到的。
12、本發(fā)明還提供了上述重組茂原鏈霉菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟：
13、(1)本發(fā)明所用的出發(fā)菌株為smy2019，由本實(shí)驗(yàn)室保存。
14、(2)在本發(fā)明中，首先通過(guò)預(yù)測(cè)軟件islandviewer4和crisprcasfinder分析發(fā)現(xiàn)s.mobaraensis?dsm40587基因組中存在18個(gè)基因組島(gis)和2個(gè)內(nèi)源crispr/cas系統(tǒng)。再經(jīng)同源序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)s.mobaraensis?dsm40587基因組存在3個(gè)nhej途徑相關(guān)基因。
15、(3)基于前期實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的crispr/cas9編輯系統(tǒng)對(duì)smy2019中5個(gè)最大的gis、所有內(nèi)源crispr/cas系統(tǒng)和nhej修復(fù)途徑的相關(guān)基因(共計(jì)167.6kb)進(jìn)行敲除。
16、(4)為進(jìn)行新一輪基于crispr/cas9系統(tǒng)的基因組編輯，快速消除菌株中帶抗性的cas9表達(dá)質(zhì)粒。挑選上述編輯成功的菌落在無(wú)抗isp4培養(yǎng)基上劃線，于37℃培養(yǎng)箱生長(zhǎng)3d以消除質(zhì)粒。
17、(5)最終得到底盤(pán)菌株smy2019-δg5-c3，使基因組減小了2.2％。隨后對(duì)其蛋白合成、生長(zhǎng)速率、轉(zhuǎn)化效率、atp能量和還原力等參數(shù)進(jìn)行評(píng)估。
18、本發(fā)明還提供了一種提高茂原鏈霉菌smy2019生長(zhǎng)速率和/或轉(zhuǎn)化效率的方法，所述方法為，敲除上述基因組島gis基因、內(nèi)源crispr/cas系統(tǒng)基因、nhej修復(fù)途徑基因中的一種或多種。
19、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法為：敲除其基因組上的基因組島gis基因。
20、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法為：敲除其基因組上的基因組島gis基因，及其基因組上的第1358697位至1368646位。
21、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法為：敲除其基因組上的基因組島gis基因，及其基因組上的內(nèi)源crispr/cas系統(tǒng)基因。
22、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法為：敲除其基因組上的基因組島gis基因、其基因組上的內(nèi)源crispr/cas系統(tǒng)基因及其nhej修復(fù)途徑基因。
23、本發(fā)明還提供了一種tgase酶的制備方法，所述方法為，采用上述底盤(pán)細(xì)胞發(fā)酵制備得到。
24、本發(fā)明還提供了一種提高茂原鏈霉菌smy2019發(fā)酵tgase酶的酶活的方法，所述方法為，敲除上述基因組島gis基因、內(nèi)源crispr/cas系統(tǒng)基因、nhej修復(fù)途徑基因中的一種或多種。
25、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法為：敲除其基因組上的基因組島gis基因；
26、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法為：敲除其基因組上的基因組島gis基因，及其基因組上的第1358697位至1368646位。
27、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法為：敲除其基因組上的基因組島gis基因，及其基因組上的內(nèi)源crispr/cas系統(tǒng)基因。
28、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法為：敲除其基因組上的基因組島gis基因、其基因組上的內(nèi)源crispr/cas系統(tǒng)基因及其nhej修復(fù)途徑基因。
29、本發(fā)明還提供了一種表達(dá)目的蛋白的方法，所述方法為，采用上述底盤(pán)細(xì)胞為宿主細(xì)胞，進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)。
30、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述目的蛋白包括不限于：tgase酶。
31、本發(fā)明還提供了上述底盤(pán)細(xì)胞，或上述方法在制備tgase酶或含有tgase酶的產(chǎn)品或在制備目的蛋白中的應(yīng)用。
32、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述目的蛋白包括不限于：tgase酶。
33、有益效果
34、(1)本發(fā)明利用crispr/cas9無(wú)抗性殘留敲除基因技術(shù)依次對(duì)smy2019基因組中5個(gè)最大的gis、2個(gè)內(nèi)源crispr/cas系統(tǒng)和3個(gè)nhej修復(fù)途徑的相關(guān)基因進(jìn)行敲除，得到基因組縮減后的底盤(pán)菌株smy2019-δg5-c3。與smy2019相比，其tgase酶活提高了37.3％，在同一發(fā)酵條件下tgase酶活遠(yuǎn)高于原始菌株。
35、(2)基因組縮減后的底盤(pán)菌株smy2019-δg5-c3與smy2019相比，atp含量和nadph/nadp+分別提高了1.3和0.53倍；且固體平板產(chǎn)孢時(shí)間由6d縮短至4d，cas9表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率提高4倍，作為底盤(pán)細(xì)胞各項(xiàng)屬性均優(yōu)于出發(fā)菌株，對(duì)該菌種的后期優(yōu)化生產(chǎn)具有重要的科學(xué)意義與應(yīng)用價(jià)值。