本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)，尤其涉及一種以魔芋葉片為外植體的魔芋組培方法。
背景技術(shù)：
1、花魔芋為天藍(lán)星科魔芋屬多年生宿根草本植物，它是目前自然界唯一能大量提取葡甘聚糖的重要經(jīng)濟(jì)作物。葡甘聚糖是一種高分子水溶性膳食纖維，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥、保健、化工、紡織等許多領(lǐng)域，具有極大的商業(yè)價值。花魔芋在我國云南、四川、湖北、陜南等山區(qū)廣泛栽培。
2、目前，花魔芋精粉(富含葡甘聚糖)的需求量逐年增加。而花魔芋是多年生草本植物，生長周期長，并且異花授粉、個體高度雜合、花期差異大、總量增加緩慢，可利用部分減少，降低了商品芋的應(yīng)用價值。魔芋繁殖系數(shù)偏低，種源不能滿足市場需求。
3、花魔芋雖然可以進(jìn)行有性生殖產(chǎn)生實生種子，但是由于花魔芋為雌雄同株植物，雄蕊先熟，造成花期不遇，授粉受精不良；并且，花粉易污染，親和性較差，因此在自然條件下較難形成種子，并且魔芋種子的休眠期也較長。此外，種子在自然環(huán)境中容易受到霉菌和其他病原體的侵襲，導(dǎo)致霉?fàn)€或敗育。因此，目前有性繁殖的花魔芋的產(chǎn)量低，實際生產(chǎn)中較少使用。
4、植物體外組織培養(yǎng)繁殖系數(shù)高，能夠有效地縮短繁殖周期，穩(wěn)定地保存母本優(yōu)良的遺傳特性。人們通常使用花魔芋的營養(yǎng)組織塊莖進(jìn)行無性繁殖(再生)，取材范圍較為局限，這種繁殖方式雖然能夠保持母株的優(yōu)良特性，但長期依賴無性繁殖會導(dǎo)致遺傳多樣性降低，使得種群更容易受到疾病和環(huán)境變化的影響，無性繁殖的后代會繼承母株的弱點和缺陷，隨著時間的推移，這些不利因素會積累會導(dǎo)致后代植株的抗性減弱，產(chǎn)量和品質(zhì)的下降；此外，魔芋塊莖在運輸貯藏過程中容易受損，致使種植時種芋腐爛，造成魔芋產(chǎn)量降低或絕收。
5、隨著組培技術(shù)的發(fā)展，人們已經(jīng)能夠使用多種作物如馬鈴薯的莖段和葉片作為外植體，以ms等基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加適量組合的植物激素，實現(xiàn)馬鈴薯再生。但據(jù)相關(guān)報道，目前，關(guān)于花魔芋的組培快繁報道較少，而葉片再生植株一直是組培上的難題，直接通過花魔芋葉片誘導(dǎo)不定芽和愈傷誘導(dǎo)不定芽的研究尚未見報道。因此，建立一種花魔芋葉片愈傷誘導(dǎo)不定芽再生植株的方法很有必要。
6、因此，現(xiàn)有技術(shù)有待進(jìn)一步改進(jìn)。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、針對上述問題，本發(fā)明提供了一種以魔芋葉片為外植體的魔芋組培方法，該方法培育的花魔芋的培苗生根率高，繁育速度快，產(chǎn)量高，可在組培企業(yè)中推廣應(yīng)用。
2、為解決上述問題，本申請?zhí)峁┮韵碌募夹g(shù)方案：
3、一種以魔芋葉片為外植體的魔芋組培方法，其包括以下步驟：
4、s1、魔芋葉片外植體的消毒：剪取健康魔芋幼嫩葉片，洗凈后進(jìn)行消毒處理，期間不斷搖動使葉片和溶液充分接觸，然后用無菌水清洗多次，無菌濾紙吸干表面水分；
5、s2、愈傷組織的誘導(dǎo)：將消毒后的外植體接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)25～35d，得到不定芽；優(yōu)選的誘導(dǎo)時間為30d；
6、s3、不定芽增殖：將獲得的不定芽接種到不定芽增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基放置在培養(yǎng)室進(jìn)行光照培養(yǎng)，溫度25～28℃，光照強(qiáng)度2000～2500lx，相對濕度45％～60％，光周期14h晝/10h夜，培養(yǎng)3～5周；可選地，培養(yǎng)4周；
7、s4、組培苗生根：選擇芽高大于2cm長勢良好的無根苗接入生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為：溫度25～28℃，光照強(qiáng)度2000～2500lx，相對濕度45％～60％，光周期14h晝/10h夜，培養(yǎng)3～5周；可選地，培養(yǎng)4周；
8、s5、組培苗的煉苗和移栽：對上一步得到的組培苗移至大棚煉苗后，再移栽至混合基質(zhì)進(jìn)行培養(yǎng)。
9、可選地，所述以魔芋葉片為外植體的魔芋組培方法中，s1步驟中，花魔芋外植體的消毒處理方法為：用75％乙醇溶液消毒30s，2％?naclo消毒15min，0.1％?hgcl2溶液處理12min。實驗證明，該消毒條件下，花魔芋葉片外植體的污染率和死亡率最低。
10、可選地，所述以魔芋葉片為外植體的魔芋組培方法中，s2步驟中，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加有1.0mg/l的6-ba和1.0mg/l?naa的ms基本培養(yǎng)基。該條件下，花魔芋葉片外植體的不定芽長出時間最短，不定芽誘導(dǎo)率最高達(dá)96.25％，愈傷組織長勢良好。
11、可選地，所述以魔芋葉片為外植體的魔芋組培方法中，s3步驟中，所述不定芽增殖培養(yǎng)基為添加有30～35g/l蔗糖、5～6g/l瓊脂、0～2.0mg/l?6-ba、0～1.0mg/l?naa、1g/l活性炭、0.1g/l的聚乙烯吡咯烷酮的ms基本培養(yǎng)基。
12、其中，聚乙烯吡咯烷酮(pvp)的作用是抗褐變和保護(hù)細(xì)胞活性，活性炭是吸附有害物質(zhì)，減少褐變。
13、優(yōu)選地，所述不定芽增殖培養(yǎng)基為添加有30～35g/l蔗糖、5～6g/l瓊脂、1.5mg/l6-ba、0.25mg/l?naa、1g/l活性炭、0.1g/l聚乙烯吡咯烷酮的ms基本培養(yǎng)基。該條件下的不定芽增殖效果最佳，葉片外植體增殖系數(shù)最高達(dá)3.34。
14、可選地，所述以魔芋葉片為外植體的魔芋組培方法中，s4步驟中，所述生根培養(yǎng)基為：添加有30～35g/l蔗糖、5～6g/l瓊脂、0.25mg/l?6-ba、1.5mg/l?naa、1g/l活性炭、0.1g/l聚乙烯吡咯烷酮的ms培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基的花魔芋無根苗生根效果最佳，平均更長最長，且根條數(shù)最多。
15、可選地，所述以魔芋葉片為外植體的魔芋組培方法中，s5步驟具體為：
16、(1)煉苗：將根長為6～10cm，根數(shù)量≥5根的組培苗帶瓶移至大棚內(nèi)，放置2～4天后打開瓶蓋，在24℃～28℃，空氣相對濕度75～90％，光強(qiáng)6000～85001x條件下煉苗4～7天；
17、(2)移栽與培養(yǎng)：將煉苗后的組培苗洗凈根部培養(yǎng)基，用殺菌劑溶液浸泡根部后移栽至混合基質(zhì)中，在25℃～30℃溫度條件下，空氣相對濕度80～95％，6500lx的條件下培育7～10d，即得到成花魔芋種苗。
18、可選地，所述以魔芋葉片為外植體的魔芋組培方法中，所述混合基質(zhì)為體積比為1:1的沙壤土和腐殖土的混合物。
19、本發(fā)明具有以下有益效果：
20、1、本發(fā)明提供一種以魔芋葉片為外植體的魔芋組培方法，該方法不僅能夠促使花魔芋葉片愈傷組織順利生根，并且生根率高達(dá)80％，所培育的組培苗移栽成活率達(dá)到90％以上，可在組培企業(yè)中推廣應(yīng)用。
21、2、所述以魔芋葉片為外植體的魔芋組培方法取材更方便，材料來源更廣，并且可避免塊莖在運輸儲藏中的損傷，培育成本更低，更易于推廣應(yīng)用。
1.一種以魔芋葉片為外植體的魔芋組培方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以魔芋葉片為外植體的魔芋組培方法，其特征在于，s1步驟中，花魔芋外植體的消毒處理方法為：用75％乙醇溶液消毒30s，2％naclo消毒15min，0.1％hgcl2溶液處理12min。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的以魔芋葉片為外植體的魔芋組培方法，其特征在于，s2步驟中，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加有1.0mg/l的6-ba和1.0mg/l?naa的ms基本培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的以魔芋葉片為外植體的魔芋組培方法，其特征在于，s3步驟中，所述不定芽增殖培養(yǎng)基為添加有30～35g/l蔗糖、5～6g/l瓊脂、0.5～2.0mg/l?6-ba、0.2～1.0mg/l?naa、1g/l活性炭、0.1g/l的聚乙烯吡咯烷酮的ms基本培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的以魔芋葉片為外植體的魔芋組培方法，其特征在于，所述不定芽增殖培養(yǎng)基為：添加有30～35g/l蔗糖、5～6g/l瓊脂、1.5mg/l6-ba、0.25mg/l?naa、1g/l活性炭、0.1g/l聚乙烯吡咯烷酮的ms基本培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的以魔芋葉片為外植體的魔芋組培方法，其特征在于，s4步驟中，所述生根培養(yǎng)基為：添加有30～35g/l蔗糖、5～6g/l瓊脂、0.25mg/l?6-ba、1.5mg/lnaa、1g/l活性炭、0.1g/l聚乙烯吡咯烷酮的ms培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的以魔芋葉片為外植體的魔芋組培方法，其特征在于，s5步驟具體為：
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的以魔芋葉片為外植體的魔芋組培方法，其特征在于，所述混合基質(zhì)為體積比為1:1的沙壤土和腐殖土的混合物。